材料和试剂

动物
1. 该研究已在成年雄性小龙虾，Procambarus上进行 clarkii ，在波尔多（法国）附近在"Réservenaturelle de 布鲁日"并且在具有12:12暗光循环的动物房子中储存。小龙虾随意饲喂颗粒（Novo Prawn）。使用小龙虾对于该研究，为8.7±0.8cm和22.1±1.1g。我们一般使用男性小龙虾在我们的实验（区分他们的第一腹部附件），但这个协议也适用于实验女性
2. 在任何实验之前，小龙虾被隔离丰富的水族箱（75厘米x 40厘米x 50厘米），充满回收含氧水和富含鹅卵石和塑料管（后面或里面可以隐藏）。将动物隔离至少3周在任何实验之前，为了擦除过去的生活史和避免社交互动。
3. 水必须不含氯（搅拌新鲜自来水24小时一般足以去除氯）。每个会话后更换水或使用常规水族箱过滤系统。
4. 鱼网用于操作小龙虾。
试剂
1. 林格：小龙虾注射了一个经典的无脊椎动物铃声含有195 NaCl，5KCl，13CaCl 2，2MgCl 2和3 HEPES （Sigma-Aldrich），pH为7.65
2. 盐酸利眠宁盐酸盐（CDZ）（Sigma-Aldrich）（溶解于小龙虾环中，并以15μg/g的剂量使用）

设备

黑暗/光（D/L）加迷宫
1. 定制装置（65×65cm，参见图1）适应于尺寸的成年小龙虾。可能需要更小或更大的尺寸小龙虾或其他物种
2. 照明臂由透明有机玻璃和不透明有机玻璃的暗臂制成（图1）。
3. 迷宫充满ca。 7 cm氧合淡水。它是                     放置在较大的圆形罐的中心（图2）。圆罐                     （直径1.5m）也填充7cm淡水以平衡                     水压在每个迷宫墙上，并允许良好的氧合和                     回收水（图2）。
  
  图1.黑暗/光加迷宫。                     迷宫的总长度为65cm×65cm。每个手臂长25厘米，长15厘米厘米宽。中间区域为15cm×15cm。光是由生成的                     四个源包括两个LED。每个光源都放在                     不透明有机玻璃的外表面。
  
  图2.黑暗/光加                         迷宫置于较大的罐（直径1.5米）中。右：房间灯                     打开。左：室内灯在实验条件下关闭。
4. 光臂的照明由一系列LED执行（白光;电压：3.5V，光强度：880〜2530mcd）设置在加号迷宫外面，在黑暗的武器的外侧最外端（见图3）。
  
  图3.位于暗臂末端的两个LED照亮一个灯臂。迷宫墙的高度为20厘米。
其他设备
1. 摄像机必须放置在迷宫上方。我们使用handycam（索尼 inc，型号：HDR-XR155），但可以使用任何商用相机
2. 在实验阶段之间将泵（NewJet）放置在大罐上以搅拌和氧化水
3. 用照度计（Chauvin Arnoux）评价光强度。

软件

我们使用Ethovision v8（Noldus），但可以使用任何跟踪软件。测量参数列于表1中
表1.可用于分析D/L加迷宫中焦虑样行为的参数列表

变量名称（和图2中使用的缩写）	定义	测量	范围
移动的总距离（距离）	距离在整个舞台上移动。	厘米	≥0
％区域中的时间（％T亮，暗）	在一个区域（黑暗或轻微）/（除以总时间）中花费的时间* 100	％	0-100
延迟到第一次亮起（Lat.Light）	从开始时间到在轻武器中第一次进入的时间	第二	0-600
在暗处延迟到第一天（Lat.Dark）	从开始时间到在黑暗的树枝中第一次进入的时间	第二	0-600
轻武器进入平均数（Nb。黑暗）	从中区到轻武器的进入次数	NA	≥0
黑暗臂中平均进入数量（Nb。ent。Light）	从中间区到暗臂的进入次数	NA	≥0
光臂中每次访问的平均持续时间	轻武器时间/平均进入次数	第二	≥0
暗室中每次访问的平均持续时间	黑暗时间/平均进入次数	第二	≥0
撤退率（RR）	撤退次数/总尝试次数	NA	0-1

程序

因为我们的迷宫已被开发来测量压力的后果，小龙虾必须提交一些紧张的情况，然后在黑暗/光加迷宫进行测试。任何压力来源都可以考虑，从天然或实验来源。先前的数据是使用电场应用于单个小龙虾获得的（Fossat等人，2014），但是我们已经验证了该方案也适合于分析社会交互的后果（Fossat等人al。，以便发布）。应考虑三组动物：无应激或对照动物，应激动物（包括注射盐水的应激动物）和注射抗焦虑药物CDZ的应激动物。
在实验之前，允许水氧合的泵被关闭，并且白色LED被打开，而室内灯被关闭。白光LED强度被调节以在光臂中产生大约50-lux的强度，在暗臂中产生10-lux的强度。
每个小龙虾用鱼网仔细地捞起并放置在放置在加号迷宫中间的不透明罐中（参见图4）。
摄像机已打开。在几秒钟内拍摄绘图板以记录实验数据（日期，动物的参考数量）。
在至少1分钟后，小龙虾通过小心地移除不透明的水槽（穿透小孔以防止水回洗）释放。小龙虾允许自由访问整个迷宫10分钟。
10分钟后，摄像机关闭。小龙虾被小心地从迷宫中移除，并在其水族馆中更换。
泵被激活以搅拌所有臂中的迷宫的淡水30秒。另一只小龙虾可以测试。
在实验结束时，从迷宫中除去淡水，用新的淡水重新填充，并且泵被激活用于氧合。
然后使用Ethovision或其他跟踪软件分析电影（参见视频1至3）。建议特别测量移动的总距离，每个手臂花费的时间，条目数，第一个条目的延迟时间，每个手臂的平均持续时间。
小龙虾在进入轻武器之前经常停止移动，然后进入或撤退。因此，可以估计作为撤退次数除以总尝试次数计算的撤退比率。

图4.包含小龙虾的不透明腔室位于加号迷宫的中心区域

代表数据

图5.注射CDZ的未受胁迫，压力和压力的小龙虾的典型路线。在无压力下，小龙虾探索整个迷宫（左图）。在紧张的情况下，小龙虾几乎探索了黑暗的武器（中图）。强调小龙虾注射CDZ，再次移向四臂。

图6.应力诱导显着的光厌恶，如通过在光臂中花费的时间的减少，光入射的平均数目的减少，光臂中第一次进入的潜伏期的增加和光臂中的第一次进入的增加（白色直方图）。注射抗焦虑分子（，CDZ）显着消除了对光的厌恶（软灰色组织图）。 *** p <0,001，** <0,01，单因素方差分析。
另见下面的电影：

视频1.显示黑暗/光加迷宫中压力小龙虾的位移

视频2.显示黑暗/光加迷宫中未受胁迫的小龙虾的位移

视频3.显示在黑暗/光加迷宫中注射CDZ的受压小龙虾的位移

笔记

确保淡水充分氧化，并尽可能使用泵。实验期间停止泵。
在两次迷宫测量之间，一定要正确搅拌水。
操作小龙虾时，小心限制压力。例如，不要立即测试当捕捞时产生重复尾巴翻动的动物
为了避免干扰小龙虾的每日节律，在所有实验的同一时间槽进行测试。如果在不同时间段进行测试，行为可能会出现偏差。
当去除不透明室时，小心，因为小龙虾可以通过尾部翻转逃脱。在这一点上，你可以将小龙虾重新定位在迷宫的中心，并做一个标记，注意发生了什么，或者更确切地说，去除动物，并将另一个放在迷宫中。
为了避免习惯，似乎更好的是测试每只动物只有一次。这意味着一系列控制个体将与系列压力动物进行比较，而不是比较每个个体在压力之前和之后的行为。

致谢

这项工作得到国家可再生能源研究中心和"阿基坦大学理事会"（2010301037）的支持。该协议改编自Fossat等人（2014）。

参考文献

Fossat，P.，Bacque-Cazenave，J.，De Deurwaerdere，P.，Delbecque，J.P。和Cattaert，D。比较行为。小龙虾的焦虑样行为由5-羟色胺控制。 344（6189）：1293-1297。
Leo，L.M。和Pamplona，F.A。（2014）。 Elevated plus maze test to assess anxiety-like behavior in the mouse。 Bio-protocol 4（16）：e1211。
Pellow，S.，Chopin，P.，File，S.E.and Briley，M。（1985）。验证开放：在高架加迷宫中的闭臂手臂条目作为大鼠焦虑的量度。 J Neurosci Methods 14（3）：149-167。