材料和试剂

Lipofectamine/plus转染试剂（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：11514-015）
胰蛋白酶-EDTA ： 25300-054）
嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号： P8833）
DPBS 编号：BE17-512F）
font-family：Arial; font-size：10pt;"> pSUPER.retro.puro载体（OligoEngine，目录号：VEC-PRT-0002） span>

设备

组织培养罩
组织培养孵化器
培养皿（BD Biosciences，Falcon ：353003）
10厘米菜</span>

程序

设计RNAi寡核苷酸以特异性干扰您喜爱的基因，并将其克隆在pRetroSUPER载体中（根据pSuper RNAi系统手册， OligoEngine ），或使用商业上可获得的shRNA载体干扰您喜爱的基因。
在转染前24小时，在RKO或H1299细胞的10号板中进行将10μlLipofectamine稀释于DMEM（750μl）中，室温孵育15分钟。 > 注意：我们使用的Lipofectamine试剂少于Invitrogen说明书中指示的。
和稀释的lipofectamine试剂，混合并在室温下孵育15分钟。同时用不含血清和抗生素（5ml）的DMEM替换细胞上的生长培养基。
将DNA-加lipofectamine复合物添加到细胞上，通过摇动平板轻轻混合孵育在37℃，5％CO
font-family：Arial; font-size：10pt;"> 孵育后用新鲜生长培养基
font-family：Arial; font-size：10pt;"> 在转染后24小时加入嘌呤霉素至终浓度为2μg/ml。
> font-size：10pt;"> 每48小时，更换生长培养基，加入新鲜嘌呤霉素。 /span>
嘌呤霉素处理后10天，单菌落应该是可见的。你可以选择单个菌落（用移液管尖端挑选，并在24孔板群中进行平板培养），或者根据你的
font-family：Arial; font-size：10pt;"> "> 允许细胞生长至80-90％汇合。 /span>
font-family：Arial; font-size：10pt;"> "> 一旦细胞达到80〜90％汇合，转移到适当的菜肴。注意：菌落可能不会同时达到80-90％汇合。
font-family：Arial; font-size：10pt;">一旦细胞达到80〜90％汇合，使液氮储存并保存一些细胞用于测量shRNA诱导的沉默（通过实时PCR或Western印迹）。/span> >
font-family：Arial; font-size：10pt;"> "> ="font-family：Arial; font-size：10pt;">为了维持含有稳定整合的载体的细胞，我们使用嘌呤霉素使终浓度为2μgml ^-1。

致谢

该方案改编自Cecchinelli等人（2006）。这项工作得到了Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro（给Soddu）的资助。我特别感谢Cinzia Rinaldo博士和Andrea Prodosmo博士提供技术支持。

参考文献

Cecchinelli，B.，Lavra，L.，Rinaldo，C.，Iacovelli，S.，Gurtner，A.，Gasbarri，A.，Ulivieri，A.，Del Prete，F.，Trovato，M.，Piaggio，，Bartolazzi，A.，Soddu，S。和Sciacchitano，S。（2006）。通过同源结构域相互作用蛋白激酶2激活的p53抑制抗细胞凋亡分子半乳凝素-3是必需的 p53诱导的凋亡。细胞生物学26（12）：4746-4757。
Invitrogen Lipofectamine/plus手册。
OligoEngine pRetroSuper手册。