材料和试剂

60毫米培养皿（Genesee Scienntific，目录号：32-105G）
90％铂，10％铱丝（Tritech Research，目录号：PT-9010）
铜环（PlumbMaster，目录号：17668）
电子。大肠杆菌OP50（明尼苏达大学，秀丽菌属遗传中心）
涕灭威（ChemService，目录号：N-11044）
乙醇（乙醇，190证明，ACS-USP级）（PHARMCO-AAPER，目录号：111000190）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C3045）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
磷酸二氢钾（KH 2 O 3 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
磷酸二钾（K 2 O 3 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
Bacto-agar（BD，Bacto ^{TM ，目录号：214040）}
Bacto-pepton（BD，Bacto ^{TM ，目录号：211820）}
100mM涕灭威储备溶液（参见食谱）
5 mg / ml胆固醇（见食谱）
1M CaCl 2储备溶液（参见食谱）
1M MgSO 4储备溶液（参见食谱）
1 M KPO 4，pH 6.0储备溶液（参见食谱）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（参见食谱）
含有涕灭威的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（参见食谱）

设备

镊子
旋转器
高压灭菌器
2升烧瓶
磁力搅拌棒
具有KL 200 LED光源（Leica Microsystems，型号：KL 200 LED）的显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica MZ6）

软件

GraphPad Prism 6.0，RRID：SCR_002798

程序

对于蠕虫的日常维护，请参阅Stiernagle，T.维护C. elegans （Stiernagle，2006）。
在测定前至少一天准备含有1mM涕灭威的NGM琼脂平板（见食谱），并在4℃下储存直至使用。常规维护的常规NGM琼脂平板应接种OP50大肠杆菌，并在测定前可用。
将30-40 L4级野生型N2和目标突变体选择在用OP50大肠杆菌（但不含涕灭威）接种的分离的NGM板上，并在20℃下培养20至24小时。
使用镊子拿起铜环并浸入70％乙醇中。将铜环阻燃几秒钟，立即将其放置在含有涕灭威的NGM琼脂平板上。铜环将轻轻地嵌入板的琼脂表面（图1）。这将是环内的珊瑚虫。在每个测定板上放置3个铜环，并加入10μlOP50E。大肠杆菌（OD 600）= 1.2）在环的中心。细菌有助于使蠕虫环绕环的中心。让板干燥30分钟。可以在同一板上测定三种基因型

图1.铜环嵌入琼脂平板的代表性图像。将三个铜环放置在60mm NGM琼脂板上，并在环的中心加入10μlOP50。
将每个基因型的20-30个蠕虫从步骤3转移到每个环的中心。记录每个环中放置的蠕虫数。每2-3分钟交错蠕虫传播，以便在10分钟的间隔内检查所有3种基因型。
以10分钟的间隔观察蠕虫。如果有蠕虫没有移动，那么用铂金丝轻轻地将其头部移动（视频1和2）。如果他们没有动摇他们的头，以反应甚至严酷的触摸，然后将其从盘子中删除并记录。继续，直到没有蠕虫。确保所有的蠕虫在整个测定中被考虑。

Video 1. A video recording of responses of worms with different genotypes in the presence of aldicarb. The video (120 frames) was recorded for 4 min after 50 min incubation on an aldicarb plate. * indicates the paralyzed worms. WT: wild-type animals, slo-1: slo-1(eg142lf), mutant: an uncharacterized mutant.

Video 2. A video recording shows paralyzed worms that do not respond to harsh touch

翻译

Data analysis

Software: Prism 6.0
Use ‘Survival analysis’ function to plot the survival graph (Figure 2). At least 20 worms of each genotype are used per assay. Repeat the assay two more times on different days (total 3 trials) and report the summary of the statistics as shown in Tables 1A and 1B.

Figure 2. Survival curve for aldicarb-induced paralysis assay. Wild-type, slo-1(ky399 gain-of-function) and slo-1(eg142 loss-of-function) mutant animals were simultaneously tested for aldicarb sensitivity in a copper ring-embedded assay plate (adapted from Oh et al., 2017).

Table 1A. Median survival time of C. elegans exposed to aldicarb (Median survival unit is minutes. The number in parenthesis is sample number)

Table 1B. P values of Log-rank test
Statistical analysis: The log-rank test is used to analyze the data. Prism software returns overall curve comparison results. However, pair-wise comparisons can be performed to compare 2 specific groups. Statistically significant P-values need to be adjusted for multiple comparisons if more than 2 pair-wise comparisons are performed. A Bonferroni corrected threshold is used to determine statistically significant P-values (http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?survival_curves.htm). In this example, 3 comparisons, N2 vs. slo-1(ky399), N2 vs. slo-1(eg142), and slo-1(ky399) vs. slo-1(eg142), are performed and P-values for each comparison is obtained. If threshold for statistical significance is set at a P-value of 0.05, then any P-value that is less than the corrected threshold, i.e., 0.05 divided by 3, is considered statistically significant in this example.

Notes

As per standard scientific procedure, the experimenter should be blinded to the genotypes of the test worms. Ideally a colleague should place the worms (procedure step 5) and label the worms to prevent the experimenter from identifying the genotypes. For mutants with obvious phenotypes, an additional mutant with a similar phenotype, which is unrelated to the study of interest, may be added.
The resolution of differential sensitivity can be changed by varying the concentration of aldicarb. For example, mutants that have higher rates of neurotransmission than wild type worms may be better distinguishable at a lower concentration of aldicarb (e.g., 0.5 mM), which increases the time for the worms to get paralyzed.

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数据分析

软件：Prism 6.0
使用“生存分析”功能绘制生存图（图2）。每个测定使用每个基因型至少20个蠕虫。在不同的日子重复测定两次（共3次试验），并报告统计数据摘要，如表1A和1B所示。

图2.涕灭威诱导麻痹测定的生存曲线。野生型，slo-1（ky399增益功能）和 slo-1
表1A。暴露于涕灭威的线虫的中位生存时间（中位生存单位为分钟，括号中的数字为样本号）

表1B。日志级别测试
的P 值
统计分析：对数秩检验用于分析数据。 Prism软件返回总体曲线比较结果。然而，可以进行成对比较以比较2个特定组。如果进行多于2次的成对比较，则需要调整统计学上显着的P 值进行多次比较。 Bonferroni校正阈值用于确定统计学显着的P 值（ http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?survival_curves.htm ）。在这个例子中，N2与 slo-1（ky399）的3个比较，N2与slo-1（eg142）和 slo-1（ky399）） vs。执行 slo-1（eg142），并且获得每个比较的 P 值。如果将统计显着性的阈值设置为0.05的P值，则小于校正阈值的任何

值，例如，0.05除以3，在本例中被认为具有统计学意义

笔记

按照标准的科学程序，实验者应该对测试蠕虫的基因型不了解。理想情况下，同事应该放置蠕虫（程序步骤5）并标记蠕虫，以防止实验者识别基因型。对于具有明显表型的突变体，可以添加与感兴趣研究无关的具有相似表型的另外的突变体。
差异灵敏度的分辨率可以通过改变涕灭威的浓度来改变。例如，具有比野生型蠕虫更高的神经传递速率的突变体可以在较低浓度的涕灭威（例如，0.5mM）下更好地区分，这增加了蠕虫瘫痪的时间。 br />

食谱

100mM涕灭威储备溶液
在室温下将100毫克涕灭威溶解在5.25毫升70％乙醇中储存于4°C
注意：我们已经储存了两周的库存，并没有尝试更长的存储空间。
5 mg / ml胆固醇
加入250毫克胆固醇在50ml的95％乙醇中，并在室温下旋转旋转混合。解散需要几个小时。在室温下存放
1M CaCl 2 储备溶液
将14.7g CaCl 2·2H 2 O在100ml ddH 2 O中溶解，并在121℃下高压灭菌30分钟。在室温下存放
1 M MgSO 4储备溶液
将12.04g MgSO 4在100ml ddH 2 O中溶解并在121℃下高压灭菌30分钟。在室温下存放
1 M KPO 4，pH 6.0储备溶液
制备500毫升1M KH 2 PO 4（一元碱性）和250毫升1 MK 2 HPO 4 / （二元）溶液。在测量1M KH 2 PO 4的pH（pH低于5）的同时，加入并搅拌1KH 2 HPO 4， / sub>，直到pH达到6.0。将需要少于250毫升的K 2 HPO 4+达到pH6.0。将溶液等分并在121℃下高压灭菌30分钟。在室温下存放
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板

在具有磁力搅拌棒的2L烧瓶中加入3g NaCl，16g Bacto-agar和2.5g Bacto-pepton在1L ddH 2 O中，
高压灭菌在121°C 30分钟
将NGM琼脂冷却至55至60℃，同时在搅拌器上搅拌，加入1ml 5mg / ml胆固醇，1ml 1M CaCl 2，1ml 1M MgSO 4 > 4 和25ml 1M KPO 4，pH 6.0，同时搅拌
分配10毫升每60毫米培养皿，让他们凝固而不扰动

含有涕灭威的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板

对于含有涕灭威的NGM板，将涕灭威溶液与胆固醇，CaCl 2，MgSO 4和1M KPO 4 ，pH 6.0，当NGM琼脂培养基冷却至55至60℃时
对于1mM的涕灭威，加入1ml 100mM的涕灭威用于100ml的NGM。倒入10毫升每60毫米培养皿，让他们干燥至少1天。板材可以在4°C下储存
注意：我们在4°C下使用的板材长达2周没有任何问题。

致谢

该协议已经从Oh等人改编（2017），eLife 6：e24733。这项工作部分得到国家卫生研究所的资助。

参考

Loria，PM，Hodgkin，J.和Hobert，O。（2004）。在秀丽隐杆线虫中影响神经肌肉信号传导的保守的突触后跨膜蛋白。 J Neurosci 24（9）：2191-2201。

哦，KH，Haney，JJ，Wang，X.，Chuang，CF，Richmond，JE and Kim，H。（2017）。＆nbsp;

Rand，JB（2007）。＆nbsp; Acetylcholine。 WormBook 30：1-21。

Richmond，JE（2006）。＆nbsp; 神经肌肉的电生理记录 C. elegans 的连接。 WormBook 6：1-8。

Richmond，JE和Jorgensen，EM（1999）。＆nbsp; 一个GABA和两个乙酰胆碱受体在秀丽隐杆线虫神经肌肉接头处起作用。 Nat Neurosci 2（9）：791-797。

Stiernagle，T。（2006）。维护℃。电影。 WormBook 11：1-11。

Sudhof，TC（2013）。 Neurotransmitter release：the last突触小泡生命中的毫秒数。神经元 80（3）：675-690。

Zhen，M. and Samuel，AD（2015）。＆nbsp; ℃。 elegans 运动：小电路，复杂功能。 Curr Opin Neurobiol 33：117-126。