材料和试剂

植物材料
1. 拟南芥植物，野生型或突变体或转基因植物
2. 授粉后6至11天开发长角果植物在温室中在以下条件下生长（13小时光照，日间温度为25℃，夜间温度为17℃ ℃），每周用矿物质营养液灌溉两次。
尼罗红（中性脂质染色，在丙酮中最终为2μg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：72485）

设备

共焦显微镜
注意：在本研究中，使用装备有HCX PL APO CS 40×1.25物镜和多线氩激光器的倒置LEICA SP2-AOBS光谱共聚焦激光显微镜（Leica Microsystems）。
镊子（Dumont No.5）（Sigma-Aldrich）
Scalpel（11 P，刀片）（Swann Norton）
玻璃载玻片或玻璃底盘，盖玻片
双眼（尼康公司，型号：SMZ1000）（Champigny sur Marne带有led环 - 照明^TM用于照明）

软件

ND-SAFIR（ http：//serpico.rennes.inria .fr/doku.php？id = software：nd-safir：index ）
AVIZO ^® FIRE（ http://www.vsg3d.com/avizo/fire ）

程序

样品准备
1. 删除发育中的种子，从2-3长角双体下与a 锋利的手术刀和镊子（DUMONT N°5），并将它们放在载玻片上或在玻璃底盘中
2. 添加一个小卷（介于20和30之间 μl）尼罗红溶液并盖上盖玻片。删除胚胎从种子的表面，通过轻轻地压在幻灯片和之间的种子盖玻片与手柄的手柄的圆形端部并观察在室温下在黑暗中温育30分钟后（见视频 1）。
  
  视频1.剖析拟南芥发育长角果的胚胎
  
  注意：您可以使用60％（v/v）甘油溶液或0.4％（w/v）的低浓度熔化琼脂糖作为封固剂，为您的染色溶液更好固定胚胎长期观察期。
共焦显微镜
1. 找到合适的胚胎，并使用40倍的目标调整焦点在子叶边缘
2. 设置光学参数以优化信噪比。
  1. 激发激光：氩激光设置为488nm的10％，用于尼罗红激发
  2. 550至650nm的发射带。
  3. 拍摄图像（90到100个厚度为0.16μm的光学切片）具有40x/1.25油镜物镜和8x数字变焦。每个部分在512×512像素的分辨率下进行的两次扫描的平均值在 x ， y ， z 参考中的空间分辨率为0.09mm×0.09mm×0.16μm。注意：
    1. 尼罗河红染色很高当与中性脂质相关时是荧光的。不过你可以如果使用太高的激光功率激发，则漂白它。根据我们经验，将激光功率降低到最小值和激光激发到10％的激光功率足够好，可以进行优良的观察并保存荧光最多一晚。
    2. 作为荧光信号通常很强，可以减少针孔尺寸为0.7透气以减小光学厚度部分。
    3. 增加扫描速度以及使用双向扫描模式将加快采集速度。
定量分析
1. 从3个不同的胚胎在类似的位置获取图像进行统计分析
2. 使用以下管道分析图像：
  1. 粗图像堆叠存在干扰的几个特性直接自动计数油体（图1）。规避这个问题，图像分割程序通过分水岭和数据提取在AVIZO ^® FIRE中在半自动化中实施管道。在TCL中开发了一个特定的模块（WshedBinSeparate）语言（工具命令语言）。程序的大纲是如图2所示。电影显示操作序列（视频 2）。
    
    图1.具有各种问题的图像堆栈的2D/3D视图防止图像分析中的直接使用。 A.具有高噪声的图像;乙。尺寸不均匀的物体; C.可变灰度级; D.对象触摸边缘
    A
    
    B
    
    C
    
    图2.图像分析流程 A.使用双阈值生成二进制图像; B.产生水印图像; C.对象的单独标记和3D渲染。 Avizo中的分段链（左）和生成的图像（右）。
    
    视频2. OB图像处理管道
  2. WshedBinSeparate模块允许通过分水岭方法分割油体图像堆栈。
  3. 输入图像是灰度级的3D堆栈。图像是第一使用ND-SAFIR使用高斯滤波器去噪声。两个阈值然后用手动指示的阈值执行操作由操作者。通过各种视觉测试来选择最佳值阈值。
  4. 高阈值允许检测大对象，而不必担心过高或低估它们，但是而不考虑小物体。
  5. 低阈值允许检测小物体而不用担心过度或大对象的低估。图像被合并产生阈值"二进制图像"。
  6. 3D距离变换（对于每个像素给出一个值图像根据其到最近对象的边界的距离附近）。
  7. 距离函数的最大值 "标记图像"即分割的准球面的中心目的。距离变换（CDT）的补码，带有标记图像用于创建"分水岭线"：分水岭算法扩展标记（如充气气球）朝向增加的值的CDT。分水岭线表示分隔的边界对象。最后，从二进制中减去分水岭线图像以获得分离的和个性化的对象（"分割的" 图片"）。分离的对象的图像然后被转换为扩展其中所述电子表格中的每个项目是标记的对象卷。

致谢

这项工作由INRA资助，特别是由G. Trigui博士的BAP（植物生物学和育种）和MIA（应用数学和信息学）部门资助。这项工作改编自Miquel等人（2014）。

参考文献

Miquel，M.，Trigui，G.，d'Andrea，S.，Kelemen，Z.，Baud，S.，Berger，A.，Deruyffelaere，C.，Trubuil，A.，Lepiniec，L.and Dubreucq，B （2014）。拟南芥种子种子发育过程中油体动力学中油质蛋白的专业化。 Plant Physiol 164（4）：1866-1878。
Pierre，S。（2003）。形态学图像分析：原理和应用。 2 ^nd版本。 Springer。