材料和试剂

来自芸苔（drepanensis cv。）（从两个月大到两年的叶）的新鲜毛状叶组织，大豆cv。 B220和番茄cv。罗马
注意：根据植物种类和毛状体分离后的后续分析类型，具有非腺毛状体的任何组织可能就足够了。然而，具有更致密的毛状体覆盖的组织将提供更大的分离毛状体的产量。
液氮
注意：必须进行安全使用液氮的培训。
无菌Millipore纯水
冰
0.4％台盼蓝（见配方）

设备

耐冻结温度的手套（Cryo手套）（VWR International，目录号：32885-736）
带有冰的聚苯乙烯绝缘盒
1毫升移液器用塑料移液器吸头
50ml BD Falcon TM锥形塑料离心管（BD，目录号：14-432-22）或塑料250ml离心瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EW-06105-20）
BD-Falcon尼龙网孔过滤器（40μm孔径）（BD Biosciences，目录号：08-771-1）
平头钳以从过滤器（Seton，目录号：AA969）去除污染的碎屑
具有圆形混合器头（用于管）和扁平混合器头（用于较大瓶）的Genie 2涡流混合器（Thermo Fisher Scientific）
-80°C冰箱
4°C冰箱
Flexidry ^TM单元（FTS Systems，目录号：4283）
受控环境温室或生长柜。
注意：植物生长条件取决于后续分析的性质。例如，植物组织的化学组成可以随着改变的光强度和温度（16小时光/8小时黑暗，至少400μE ）而发生实质性变化。 em > ，建议使用20/17°C，但光强度为700-1,400μE ^{em>将模仿外面的日光）。}
Axiovert 100显微镜（ZEISS），放大10倍

程序

B的健康毛状体叶。 villosa，大豆和番茄在温室中生长后选择注意：对于B. villosa，可以使用高达2年的植物叶子。
基于用于分离毛状体的容器的尺寸将收获的叶切成不同的尺寸（参见下面的视频1）。
注意：如果使用50ml管，则使用一个3cm×3cm的叶片，如果使用250ml离心瓶，则使用两个10cm×4cm的条。管和组织大小的选择取决于随后分析所需的毛状体组织的量（参见下面的建议）。对于使用的任何叶片尺寸，获得的最大纯度毛状体制剂是存在于叶片上的总毛状体的约20％。
最大30％的管或瓶填充有液体N 2并盖上（松散地旋拧）以防止混合期间的溢流（没有管从N 2蒸汽压力破坏）。
使用手套，使用Genie 2涡流混合器以最大速度（水平8）将管在液体N 2中混合1分钟。一分钟涡旋使分离的毛状体的恢复最大化，同时将叶组织的破坏最小化为稍后难以去除的小污染性碎片。
然后将管在冰上保持完全打开，以最大化液体N 2蒸发
使用镊子从管中手工除去大叶片，并保留为毛状体剥离的叶对照样品。
通过在2ml无菌Millipore纯化水中涡旋，轻轻悬浮粘附于管内壁的释放的毛状物。
将最初在管中冷冻的水（因为液体N 2）保持在冰上3-4分钟以解冻。
将来自具有毛状体（以及微小叶片）的管的解冻水通过BD-Falcon尼龙网孔过滤器筛分到新鲜的50ml管中。
再次使用镊子手动移除细胞滤网上的小片叶。
然后将过滤器在同一新鲜试管上倒置
通过使用另外的1-2ml Millipore水（参见下面的视频1）轻轻地将它们扫除（即，用移液管冲洗过滤器），将毛状体移入管中。
注意：细胞过滤器可以在孔堵塞之前使用高达8-10次。强烈的细致清洁将有助于将过滤器的使用时间再延长2-3倍，但是在堵塞孔隙之后，最好使用新的过滤器，并且进一步清洁将在过滤器中产生一个孔。
将新鲜制备的毛状体批次（在水中）和毛状体脱落叶（对照）立即在4℃下储存，直到所有组织切片被加工。
通过加入0.5ml的0.4％台盼蓝将1ml含有毛的水染色为新鲜。将内容物在室温（光照或黑暗）下孵育3-4小时，而不在培养皿中摇动以准备显微镜检查。
使用Axiovert 100显微镜（10×放大率）来确认未破裂的毛状体细胞的比例和制剂的质量。
注意：
1. 毛状体分离方案没有洗涤步骤，而是获得毛状体的图像（图1），我们使用水进行洗涤步骤以改善毛状体的外观。
2. 完整单元格未染色破碎的细胞染成蓝色;质量差的准备将含有更多的破坏的毛状体和/或更大比例的污染叶片组织碎片与图1相比。
然后将样品在液N 2中快速冷冻，在-80℃下储存4-5小时，并在Flexidry TM单元中冷冻干燥过夜。 >
该方法可用于从其他植物物种中纯化非腺毛状体（图1）
建议的用于分离B的叶样本大小。（具有300-500μm毛状体长度，〜4,000毛状/cm 2和1mg干燥毛状体从100g新鲜叶组织[FL]分离的叶）：（a）用于电子显微镜结构分析（100/cm 2）; （b）用于RNA分离（300μgFL）; （c）用于生化提取（500g FL）;用于HPLC-UV分析（500g FL）;用于NMR结构分析（800-1,000g FL）;用于通过电感耦合等离子体质谱（500g FL）的金属含量分析

图1.在从芸苔属分离后放大10倍的高品质毛状体制剂最大大豆）c蕃茄（ Solanum lycopersicum 表示污染叶组织碎片或断裂的毛状体

代表数据

视频1.毛茛从
芸苔中分离的详细步骤

食谱

0.4％台盼蓝
将40mg台盼蓝溶于100ml微孔过滤的水中

致谢

这项研究得到了加拿大Canola委员会，Sask-Canola，萨斯喀彻温农业发展基金，以及加拿大农业和农业食品部的资助。

参考文献

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