材料和试剂

解剖的玫瑰花叶从拟南芥
来自开放花的花瓣
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459844）
水合氯醛（Sigma-Aldrich，目录号：15307）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7757）
洗涤液（见配方）
清除解决方案（参见配方）

设备

立体显微镜（Zeiss，型号：Zeiss Stemi 2000）
数码相机（佳能，型号：Canon powershot S5IS）
玻璃载玻片和薄盖玻片
具有CCD照相机（Nikon Corporation，型号：DS-Ri1）的微分干涉对比（DIC）显微镜（尼康公司，型号：ECLIPSE 80i）

软件

Image J软件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html ）。
单元计数器插件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/cell -counter.html ）

程序

在研究的特定阶段从植物中解剖子叶，叶和花瓣
测量解剖的子叶和叶的面积（图1a）

图1.用于面积测量和毛孔数计数的图像（a）。显示了布置在白色表面上的子叶，条= 1cm。照片是用数字照相机拍摄的。（b）。显示拟南芥叶的近轴表面上的毛状体。照片是通过立体显微镜用数码相机拍摄的。
1. 标记来自同一植物的子叶/叶，将样品置于白色表面上，并尽量使其保持平坦。
2. 在中间（如果可能）设置1厘米的标度，并用数码相机拍摄照片。
3. 使用Image J软件（Flash 1）测量单个子叶或叶片的面积。
闪光灯1.闪光灯显示使用ImageJ 测量图1a中子叶面积的步骤
Trichome数量和密度。
1. 用立体显微镜下的鳞片拍摄单个叶子，并确保毛状体清晰（图1b）。
2. 用Image J软件（Flash 2）和测量叶片的面积使用Image J中的Cell Counter插件计算总毛数软件（Flash 3）。
3. 毛状体密度是通过毛状体的总细胞数除以叶面积计算的
  
  Flash 2.闪光灯显示使用ImageJ测量单个叶子的步骤
  
  Flash 3.闪光灯显示如何在ImageJ中使用单元格计数器插件
通过在70％乙醇中浸泡过夜固定样品; 通过清洗样品2〜3次清除叶绿素，直到清洗液（70％乙醇）变清。每次，将样品浸泡在洗涤液中1-2小时注意：轻轻拿取样品以避免细胞结构破坏，无涡流。
将样品浸泡在透明溶液-Hoyer溶液中，使组织透明。如有必要，请更改清除溶液1-2次。
注意：
1. 轻轻处理样品，避免细胞结构破坏，无涡旋。
2. Hoyer的解决方案使样品透明和柔软。在这里方法，在DIC下可观察到不同层的组织显微镜无解剖不同层。为了良好的观察，组织样品应该是透明的。软化样品 Hoyer的解决方案适合样品安装。
准备显微镜载玻片：在玻璃载玻片上加入几滴Hoyer溶液; 将一片样品（处理的子叶，叶或花瓣）平放在载玻片的表面上; 小心地用盖玻片覆盖载玻片，并尽量避免气泡
花瓣区域的测量。
1. 在4x微分干涉下拍摄整个花瓣的照片对比度（DIC）光学，确保花瓣的边缘清晰。
2. 使用Image J软件测量花瓣的面积。
在DIC显微镜上，拍摄中间静脉和边缘之间的子叶，叶或花瓣叶片的不同细胞层中的中心区域的图像。
注意：对于子叶和叶片，在DIC光学下可以清楚地观察到三层：近轴表皮层，栅状叶肉层和背面表皮层;对于花瓣，在DIC显微镜下可以容易地观察到在正轴表皮和远轴表皮中的细胞（图2）。

图2.显示在差异干涉对比（DIC）显微镜下的三层拟南芥叶。图像显示第二表面中的近轴表皮，栅栏叶肉和背面表皮细胞来自25日龄Wt（行a）和突变（行b）行的叶对。比例尺：100μm（从参考文献1中再现;图4a在手稿中： http： //onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.12228/full ）
使用Image J软件中的Cell Counter插件（http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html）计数1024×768像素区域中不同类型的细胞和气孔的数量（与所示的相同在Flash 3）。
注意：对于子叶和叶片的表皮，我们可以计算同一图像中的气孔和铺路细胞数目。对于位于图像边缘的路面细胞或气孔，如果超过一半的细胞/气孔区域在显微镜视野内，则计数;否则，不要算。对同一批次的测定使用相同的标准。
在不同的DIC光学中测量图像的1024 x 768像素区域的实际面积。
计算细胞/气孔密度和细胞大小。
1. 对于子叶和叶片，细胞/气孔密度可以是从图像中的细胞和气孔的总数计算除以图像的实际面积。
  来自25日龄Wt（行a）和突变（行b）行的叶对。比例尺：100μm（从参考文献1中再现;图4a在手稿中： http： //onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.12228/full ）
2. 使用Image J软件中的Cell Counter插件（http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html）计数1024×768像素区域中不同类型的细胞和气孔的数量（与所示的相同在Flash 3）。
  注意：对于子叶和叶片的表皮，我们可以计算同一图像中的气孔和铺路细胞数目。对于位于图像边缘的路面细胞或气孔，如果超过一半的细胞/气孔区域在显微镜视野内，则计数;否则，不要算。对同一批次的测定使用相同的标准。
3. 在不同的DIC光学中测量图像的1024 x 768像素区域的实际面积。
4. 计算细胞/气孔密度和细胞大小。
  1. 对于子叶和叶片，细胞/气孔密度可以是从图像中的细胞和气孔的总数计算除以图像的实际面积。
    ... Chloral hydrate/water/glycerol (8 W: 2 V: 1 V)
  Acknowledgments
  
  This protocol was developed in association with the study as previously published (Cheng et al., 2013). It was expanded and the full protocol with additional data is only described here. Y.Z. thanks the Ministry of Science and Technology and National Natural Science Foundation of China, and H.W. thanks the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada for financial support.
  
  References
  1. Anderson, L. E. (1954). Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist: 242-244.
  2. Cheng，Y.，Cao，L.，Wang，S.，Li，Y.，Shi，X.，Liu，H.，Li，L.，Zhang，Z.，Fowke，LC，Wang，，Y.（2013）。下调多种CDK抑制剂ICK/KRP基因上调E2F通路并增加细胞增殖，器官和种子大小在拟南芥中。植物J 75（4）：642-655。