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Analysis of the Incorporation of Carbon Atoms from Radioactive Lactate into Proteins
碳原子从放射性乳酸盐掺入到蛋白质的分析   

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本文章节

Abstract

This method allows to analyze if the carbon atoms of lactate are embedded into proteins. Indeed, mammalian cells express the transporter of monocarboxylic acids (called MCT1) that allows the entry of lactate into the cell. To this end, cells are incubated for 24 h with the culture medium containing lactate uniformly labeled with carbon 14 and then, lactate inside the cell is evaluated by counting the radioactivity by a scintillator.

Materials and Reagents

  1. [U-14C] lactate (U: uniformly labelled) (PerkinElmer, catalog number: NEC599250UC )
  2. Phosphate buffered saline (pH 7) (Sigma-Aldrich, catalog number: D8537 )
  3. Trichloroacetic acid (Sigma-Aldrich, catalog number: T6399 )
  4. Liquid scintillation (PerkinElmer, catalog number: 6NE9529 )
  5. Vials for scintillator (PerkinElmer)
  6. Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
  7. Eppendorf tube
  8. Water
  9. Cell scrapers (Euroclone)

Equipment

  1. Incubator for cell culture
  2. Petri dish for cell culture (six inches diameter)
  3. Scintillator
  4. Burker chamber

Procedure

  1. Count cells using Burker chamber.
  2. Plate 30,000 cells in each plate (six inches diameter).
  3. Add to culture medium [U-14C] lactate (2 μCi/ml, final concentration).
  4. Place the cells in incubator at 37 °C, 5% CO2 for 24 h.
  5. Wash cells with 2 ml of PBS.
  6. Add to cells 1 ml of 20% trichloroacetic acid.
  7. Rupture the cells with the scrapers.
  8. Recover the cells and put them in an Eppendorf tube.
  9. Leave in ice for 30 min.
  10. Centrifuge at 12,000 x g for 15 min at room temperature.
  11. Remove the supernatant and resuspend the pellet with 200 μl of water.
  12. Put 2 ml of scintillation liquid in a vial for scintillation.
  13. Transfer an equal volume of resuspended pellet in the vial containing the scintillation liquid.
  14. The resuspended pellet was assayed for [14C] labelled proteins by liquid scintillation counting.

Acknowledgments

This protocol is adapted from Fiaschi et al. (2012).

References

  1. Fiaschi, T., Marini, A., Giannoni, E., Taddei, M. L., Gandellini, P., De Donatis, A., Lanciotti, M., Serni, S., Cirri, P. and Chiarugi, P. (2012). Reciprocal metabolic reprogramming through lactate shuttle coordinately influences tumor-stroma interplay. Cancer Res 72(19): 5130-5140.

简介

该方法允许分析乳酸盐的碳原子是否嵌入蛋白质。 实际上,哺乳动物细胞表达允许乳酸进入细胞的单羧酸(称为MCT1)的转运蛋白。 为此,将细胞与含有用碳14均匀标记的乳酸盐的培养基一起温育24小时,然后通过用闪烁体计数放射性来评价细胞内的乳酸盐。

材料和试剂

  1. [U- 14 C]乳酸盐(U:均匀标记)(PerkinElmer,目录号:NEC599250UC)
  2. 磷酸盐缓冲盐水(pH7)(Sigma-Aldrich,目录号:D8537)
  3. 三氯乙酸(Sigma-Aldrich,目录号:T6399)
  4. 液体闪烁(PerkinElmer,目录号:6NE9529)
  5. 闪烁体小瓶(PerkinElmer)
  6. Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)
  7. Eppendorf管

  8. 细胞刮刀(Euroclone)

设备

  1. 用于细胞培养的培养箱
  2. 用于细胞培养的培养皿(6英寸直径)
  3. 闪烁器
  4. 开口室

程序

  1. 使用Burker室计数细胞
  2. 在每个板中铺板30,000个细胞(直径6英寸)。
  3. 加入培养基[U- 14 C]乳酸盐(2μCi/ml,终浓度)。
  4. 将细胞置于37℃,5%CO 2的培养箱中24小时
  5. 用2ml PBS洗涤细胞。
  6. 加入细胞1ml的20%三氯乙酸
  7. 用刮刀破碎细胞。
  8. 回收细胞,并将它们放在Eppendorf管中
  9. 在冰中放置30分钟。
  10. 在室温下以12,000xg离心15分钟。
  11. 取出上清液,用200μl水重悬沉淀。
  12. 将2毫升闪烁液放入小瓶中闪烁
  13. 在含有闪烁液的小瓶中转移等体积的重悬浮沉淀。
  14. 通过液体闪烁计数测定重悬的沉淀物的[14 C]标记的蛋白质。

致谢

该协议改编自Fiaschi等人(2012)。

参考文献

  1. Fiaschi,T.,Marini,A.,Giannoni,E.,Taddei,ML,Gandellini,P.,De Donatis,A.,Lanciotti,M.,Serni,S.,Cirri,P.and Chiarugi, 2012)。 通过乳酸盐穿梭的交互代谢重编程协调影响肿瘤 - 基质相互作用。癌症 Res 72(19):5130-5140。
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Copyright: © 2017 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Fiaschi, T. and Chiarugi, P. (2013). Analysis of the Incorporation of Carbon Atoms from Radioactive Lactate into Proteins . Bio-protocol 3(13): e812. DOI: 10.21769/BioProtoc.812.
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