材料和试剂

6厘米细胞培养皿（Greiner Bio One International，目录号：628160）
无菌移液器过滤嘴20μl（Greiner Bio One International，目录号：774288）
无菌移液器过滤嘴200μl（Greiner Bio One International，目录号：739288）
无菌移液器过滤嘴1000μl（Greiner Bio One International，目录号：740288）
15ml离心管（Greiner Bio One International，目录号：188261）
50ml离心管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
1.8毫升圆底低温管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：375418）
10厘米细胞培养皿（Greiner Bio One International，目录号：664160）
3.5厘米细胞培养皿（Greiner Bio One International，目录号：627160）
棉羊毛
真空过滤器/储存瓶系统，0.22μm，500ml（Corning，目录号：431097）
0.22μm注射器过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：Z741948）
制造商：GVS，目录号：1214220。
10 ml注射器（SFM医院产品，目录号：534235）
2 ml血清移液管（Greiner Bio One International，目录号：710180）
5 ml血清移液管（Greiner Bio One International，目录号：606180）
10 ml血清移液管（Greiner Bio One International，目录号：607107）
25 ml血清移液管（Greiner Bio One International，目录号：760160）
C57BL / 6小鼠
无菌蒸馏水
乙醇96％（Sigma-Aldrich，目录号：24105）
注意：本产品已停产。
台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15250061）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
碘化丙啶（PI）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：P3566）
细胞培养基成分

DMEM低葡萄糖，粉末（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31600083）
GlutaMax（100x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：35050038）
青霉素 - 链霉素（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
碳酸氢钠细胞培养级（AppliChem，目录号：A0384）

两性霉素B（0.25mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15290018）
来自<溶解性Clostridium histolyticum 的胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C2674）
胎牛血清（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SV30160.03）
磷酸缓冲盐水（PBS），pH 7.4片（Thermo Fisher Scientific，目录号：18912014）
来自猪胰腺的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4799）
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
DMEM低葡萄糖培养基（参见食谱）
MSC隔离介质（见配方）
胶原酶溶液（参见食谱）
MSC生长培养基（见食谱）
1x磷酸缓冲盐水（PBS）pH 7.4（参见食谱）
胰蛋白酶溶液（参见食谱）

设备

消毒手术工具包括镊子和剪刀
移液器控制器（Corning，目录号：4091）
自动单通道移液器，0.5-20,20-200和100-1,000μl，Gilson兼容（Gilson）
分析天平*
恒温摇床（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Innova ® 4000）
注意：此项目已被停用。可能的替代品：Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Innova ® sup> 40。
离心机5810 R（Eppendorf，型号：5810 R，目录号：5811000320）
Multigas孵化器（SANYO，型号：MCO-19M）
注意：此项目已被停用。可能的替代品：Panasonic Healthcare，型号：MCO-170M。
层流组织培养罩*
倒置显微镜*
血细胞计数器*
冰箱*
超低温冷冻机（Panasonic Healthcare，目录号：MDF-U3386S）
定位器6 Plus机架和箱系统，液氮罐（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：CY50985-70）
高压灭菌器*

*注意：该项目可以从任何合格的公司订购。

程序

小鼠MSC的分离
注意：在无菌条件下执行所有操作。为了保持消化条件在随后的细胞分离之间可重现，在关键胶原酶消化步骤期间溶液的体积基于脂肪组织的重量来确定。
1. 牺牲小鼠颈椎脱位。通过浸入70％乙醇中灭菌5-10分钟来灭菌动物注意：小鼠也可以通过CO 2 吸入或其他批准的方法进行安乐死。用于隔离的动物数量取决于设定的目标。鉴于MSC的扩张能力很强，一到两只动物对大多数应用来说都是足够的。
2. 解剖腹部皮肤以暴露皮下脂肪组织（视频1）。
  
  Video 1. Mouse dissection
3. 使用无菌镊子和剪刀提取皮下脂肪组织（视频2）
  
  Video 2. Excision of adipose tissue
4. 将提取的组织放置在预先加重的6厘米培养皿中。使用分析天平测量提取的组织的重量（N g）。
5. 将室温MSC分离培养基（见食谱）的1x N ml（其中N是脂肪组织的重量）加到含有脂肪组织的培养皿中。
  注意：虽然脂肪组织可以在MSC分离培养基中停留一段时间，直到胶原酶溶液（参见食谱）用于组织解离，但建议仅为此步骤招募一名助手，其任务是制备胶原酶确定提取的脂肪组织的重量后的溶液。
6. 用无菌剪刀将脂肪组织切碎，直至形成精细拼接的浆液（视频3）
  
  Video 3. Mincing of adipose tissue
7. 将提取的组织放置在预先加重的6厘米培养皿中。使用分析天平测量提取的组织的重量（N g）。
8. 将室温MSC分离培养基（见食谱）的1x N ml（其中N是脂肪组织的重量）加到含有脂肪组织的培养皿中。
  注意：虽然脂肪组织可以在MSC分离培养基中停留一段时间，直到胶原酶溶液（参见食谱）用于组织解离，但建议仅为此步骤招募一名助手，其任务是制备胶原酶确定提取的脂肪组织的重量后的溶液。
9. 用无菌剪刀将脂肪组织切碎，直至形成精细拼接的浆液（视频3）
  
  Video 4. Treatment with collagenase and centrifugation
10. 使用10ml移液管将所得细胞悬浮液上下移动20-30次，直到均匀
11. 在370℃离心细胞悬浮液在22℃下10分钟（视频4）。
12. 丢弃上清液，加入1 ml的MSC分离培养基，并使用1 ml过滤嘴重悬细胞。加入9 ml的MSC分离培养基，混合并在370℃离心22分钟10分钟（视频4）。
13. 再次重复步骤A12。将细胞重悬于1ml的MSC生长培养基中（见食谱）
14. 使用血细胞计数器计数分离细胞的总数。
  注意：在这个阶段，孤立细胞的平均数量是可变的，但通常每只小鼠约5-15万个细胞。
15. 每10厘米培养皿种子5至700万个细胞，每个培养皿加入MSC生长培养基至终体积为10ml，并在缺氧条件下于CO 2培养箱中于37℃培养（ 5％CO 2，5％O 2）（视频4）。
  注意：当添加MSC生长培养基时，目的是通过倾斜和/或使用移液管将细胞均匀分布在整个盘中。
16. 文化通道零细胞5-7天达70-80％融合，MSC生长培养基在第一天和每3天后变化。在这个阶段的细胞有一个稍长的成纤维细胞样的形状
17. 倾斜培养皿，并从塑料连接的细胞中小心地吸出培养基，避免其干扰和分离，用1x PBS洗涤一次（参见食谱）。
18. 向每个10 cm培养皿中加入1 ml胰蛋白酶溶液（见食谱），37℃下分离细胞5-10分钟。
  注意：孵育5分钟后，显微镜观察细胞脱离程度;如果需要，延长孵化，直到绝大多数细胞分离，但不超过10分钟（见注3）。
19. 将细胞转移到15ml离心管中，加入5ml MSC生长培养基，通过轻轻移液混合并在370×g下室温离心7分钟。
20. 将细胞悬浮于1-2ml的MSC生长培养基中。
21. 用等体积的台盼蓝溶液混合细胞等分试样，并使用血细胞计数器计数活细胞
扩大小鼠MSC /
注意：在无菌条件下执行所有操作。
1. 将MSC细胞悬浮液以200至400个细胞/ cm 2的密度将MSC细胞接种到合适的培养容器中。
2. 在低氧条件（5％CO 2，5％O 2）的CO 2培养箱中，在MSC生长培养基中培养细胞3至4天，）直至达到50％至70％汇合。每3天换一次媒体。
  注意：
3. 用胰蛋白酶分离细胞，并按照上述步骤A的步骤A16-A20进行计数。
4. 重复步骤B1-B3，直到获得所需数量的MSC。
  
  图1.小鼠脂肪组织在缺氧（5％O <2> ）和常氧条件下的扩增细胞在3.5cm培养皿中以200个细胞/ cm 2的密度接种，并在MSC生长培养基中培养4天，然后转移到下一道。 Y轴描绘了膨胀因子的大小，其定义为在通道结束时收集的活细胞数与接种活细胞数量的比率。数据以平均值±SD表示。与在缺氧条件下生长的细胞相比，在正常氧条件下生长的细胞在4代中显示较低的生长速率和更快的增殖下降。重要的是，正常氧中的小鼠MSC不会增长超过3-4周，而缺氧的小鼠可以在衰老前增殖至少8-9周。
冻结MSCs
注意：在无菌条件下执行所有操作。以下方案用于冻结4-5百万个细胞（8-10个冷冻细胞样品）。如果需要，按照协议扩大或缩小以适应所需的单元格号。
1. 在缺氧条件下，在六个10厘米培养皿中培养MSC，直至达到70％至80％的汇合度。
2. 如上所述，每个皿用1ml胰蛋白酶溶液分离细胞。
3. 将细胞转移到15 ml离心管中，加入5ml MSC生长培养基，用移液管混合，室温下离心3分钟，速度为370 x g。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于4 ml生长培养基中
5. 使用血细胞计数器计数活细胞的总数，如步骤A的步骤A22所述注意：收集的单元格的总数预计约为4-5 x 10
  />
6. 加入细胞5ml 5ml胎牛血清
7. 向细胞中加入1ml DMSO。应该向保持恒定搅拌（涡旋）的细胞滴加注意：加入DMSO后，由于高浓度的DMSO对细胞有害，因此应及时进行细胞随后的手术。
8. 将1.0ml细胞悬浮液等分成预先标记的冷冻管（总共8-10个冻管）。
9. 将低温管放入衬有棉绒的箱子中，并转移到-80°C的冷冻箱中2-3天。
10. 将冷冻管转移到液氮罐中
解冻MSC
注意：在无菌条件下执行所有操作。下面的方案设计用于解冻一个冷冻细胞样品。如有必要，可以扩展协议以适应所需的单元格号。
1. 用冷冻的MSCs从液氮罐中取出冷冻管，让细胞在室温下解冻注意：确保细胞在10分钟内完全解冻。手工升温可用于加快过程。
2. 将10 ml的MSC生长培养基加入到15 ml离心管中，并将解冻的细胞转移到同一管中
3. 在370×g下室温离心细胞7分钟。
4. 使用移液管小心吸出上清液，将细胞悬浮于1ml的MSC生长培养基中
5. 使用血细胞计数器计数活细胞的总数，如步骤A的步骤A22所述注意：此阶段的活细胞总数可能有所不同，但通常每个冻结细胞样本约为250-350千克。
6. 将细胞转移到10厘米培养皿中，加入MSC生长培养基至终体积为10毫升
7. 在低氧条件（5％CO 2，5％O 2）中的CO 2培养箱中的MSC生长培养基中培养细胞，直至达到50％至70％汇合。每3天换一次媒体。
  注意：5至7天的生长被认为足以使细胞恢复并获得正常的生理状态。

数据分析

使用方法A和方法B分离和扩增的细胞的质量评估主要通过使用针对小鼠MSC的基本细胞表面标志物的抗体的流式细胞术进行进行，即阳性表面标志物CD29，CD44，CD105和阴性标记物CD45，CD11b，CD34 。第2代后，扩增的MSC群体对于CD29和CD44标记预期为98-99％阳性，CD11b，CD45和CD34标记为98-99％为阴性，而CD105表达则为异质性（见图2 ）。此外，可以进行分化为骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞（Sun等人，2003），以证明扩增细胞群体的多谱系分化能力。孤立的MSC群体应显示出快速生长，培养前3-4周的群体繁殖时间为12至16 h 注意：根据分析条件，CD34阳性细胞的百分比可能会变化并高于1-2％。

图2.通过流式细胞术检测小鼠脂肪组织MSC的细胞表面表型细胞用碘化丙啶（PI）染色，分析活细胞（PI阴性门控）细胞结合荧光标记的抗体针对阳性标志物CD29和CD44，部分阳性标记物CD105，弱阳性标志物CD34和阴性标志物CD11b和CD45。

笔记

对于细胞分离，通常使用约8周龄的雌性小鼠
在所述方案中，不使用通过细胞过滤器过滤除去剩余的未消化的脂肪组织块，因为这可能导致细胞的捕获和损失。组织块不会干扰细胞生长，并且最终在培养基更换期间被去除
胰蛋白酶处理不应超过10分钟，因为较长的暴露可能会对细胞状态产生负面影响
在培养基扩张前，应将细胞培养至37°C
所描述的培养条件由我们经验确定，因为在低播种密度和亚融合条件下由于显着的生长迟缓而提供最快的扩张率。
在最佳缺氧培养条件下，小鼠MSC可以在衰老之前经历大约80次群体倍增。我们在缺氧生长条件下从未观察到这些细胞的自发永生化或转化

食谱

DMEM低葡萄糖培养基（5升）
50克DMEM低葡萄糖培养基粉末 18.5g碳酸氢钠细胞培养等级
加水至最终体积5升
真空过滤灭菌
储存于4°C
6个月内使用
MSC隔离培养基（100 ml）
93毫升DMEM低葡萄糖培养基 5 ml青霉素 - 链霉素（100x）
2 ml两性霉素B
在层流罩下组合无菌组件
储存于4°C
1个月内使用
胶原酶溶液（新鲜准备）
胶原酶12x N mg（其中N是脂肪组织的重量）
MSC隔离介质0.6x N ml
在层流罩下通过0.22mm过滤器过滤灭菌
MSC生长培养基（1L）
880毫升DMEM低葡萄糖培养基 100毫升胎牛血清
10 ml GlutaMax（100x）
10 ml青霉素 - 链霉素（100x）
在层流罩下组合无菌组件
储存于4°C
1个月内使用
1x磷酸缓冲盐水（PBS）pH 7.4（1L）
2片PBS（10克）
加水至最终体积为1升
高压消毒灭菌
在室温下存放
胰蛋白酶溶液（500毫升）
1片PBS（5克）
100毫克EDTA
1.25克胰蛋白酶
加水至最终体积为500 ml
通过过滤溶解和灭菌
储存于4°C
6个月内使用

致谢

本文描述的方案适应于Andreeva等人（2015）的修改。这项工作得到俄罗斯基础研究基金会批准的第17-04-02127号和俄罗斯科学院主席团发展生物医学技术的基础研究项目的支持。

参考

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