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Synthesis of 5’ end-labeled RNA
5'末端标记RNA的合成   

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本文章节

Abstract

5’ end-labeled RNA molecules are useful substrates to analyse the endo- and exonucleolytic activities of various ribonucleases. Here two protocols are given to synthesize P32 labeled RNAs with a 5’ PPP or 5’ P moiety. 5’ exoribonucleases generally do not work on 5’ PPP RNA and require a 5’ P substrate. The activity of certain endoribonucleases like Escherichia coli (E. coli) RNase E or Bacillus subtilis (B. subtilis) RNase Y can be stimulated by a 5’ P moiety.

Keywords: RNA Labeling(RNA标记), RNA Synthesis(RNA合成), Radioactive labeling(放射性标记)

Materials and Reagents

  1. RQ1 DNase (Promega Corporation, catalog number: M6101 )
  2. Calf intestinal phosphatase (F. Hoffmann-La Roche, catalog number:  713023 )
  3. Phenol/Chlorophorm (1:1) (MP Biomedicals, catalog number: AQUAPH01 )/ 
    (Carlo Erba, catalog number: 438601 )
  4. T7 RNA polymérase (Promega Corporation, catalog number: P207B )
  5. T4 Polynucleotide Kinase (Biolabs, catalog number: M0201 )
  6. RNasin RNase inhibitor (Promega Corporation, catalog number: N2611 )
  7. DTT (Promega Corporation, catalog number: P117B )
  8. NTPs (F. Hoffmann-La Roche, catalog number: set1277057 )
  9. γ32P GTP (6,000 Ci/mmole, 10 μC/μl) (PerkinElmer, catalog number: BLU504Z )
  10. γ32P ATP (3,000 Ci/mmole, 10 μCi/μl) (PerkinElmer, catalog number: BLU502A )
  11. 3 M NaOAc (pH 4.7) (see Recipes) 

Equipment

  1. IllustraTM MicroSpinTM G-25 column (GE Healthcare, model: 27-5325-01 )

Procedure

  1. Synthesis of 5’-P RNA  
    1. In vitro Transcription (30 μl)
      T7 RNA polymerase 5x buffer           6 μl
      RNasin (40 U/μl)                                0.75 μl
      100 mM DTT                                      3 μl
      2.5 mM NTPs                                     6 μl
      DNA template (PCR fragment)          400 ng
      H2O (RNase free)                              to final volume (30 μl)
      T7 RNA polymerase (20 U/μl)           1.5 μl
      1. Incubation 1 h 30 min at 37 °C.
      2. Add to the reaction mix 2 μl of RQ1 DNase (1 U/μl).
      3. Incubation 30 min at 37 °C (digestion of template DNA).
      4. Put on ice to stop reaction.
      5. Addition of 18 μl H2O to bring volume to 50 μl.
      6. Purification of RNA by Spin-G25 column (load sample on gel bed, centrifuge 2 min at 735 x g (~3,000 rpm in a microfuge).
    2. Dephosphorylation step (50 μl)
      Calf intestinal phosphatase (CIP 1 U/μl)                    2.5 μl
      CIP 10x buffer                                                            5 μl
      Purified RNA                                                              32.5 μl
      H2O                                                                            10 μl
      1. Incubation 30 min at 37 °C.
      2. Add 1 vol of Phenol/Chlorophorm (1:1), vortex 3 min.
      3. Centrifuge 3 min at >10,000 x g to separate phases.
      4. Precipitate upper aqueous phase by adding 1/10 vol. 3 M NaOAc (pH 4.7) + 3 vol. ETOH (96 %).
      5. Centrifuge 10 min at >10,000 x g, take off EtOH and wash pellet once with 70% EtOH by inverting tube.
      6. Air-dry pellet and take up the RNA in the desired volume of H2O.
    3. Labelling reaction (20 μl)
      Dephosphorylated RNA                                            1 μg
      T4 Polynucleotide Kinase 10x buffer                         2 μl
      RNase inhibitor (40 U/μl)                                           0.25 μl
      γ32P ATP (10 μCi/μl)                                                  5 μl
      T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μl)                           1.25 μl
      H2O                                                                            to 20 μl final volume
      1. Incubate 2 h at 37 °C.
      2. Precipitation as in step 2 and take up the pellet in desired volume.

  2. Synthesis of 5’-PPP RNA
    T7 RNA polymerase 5x buffer                       6 μl
    RNasin (40 U/μl)                                            0.75 μl
    DTT (100 mM)                                               3 μl
    ATP, UTP, CTP (2.5 mM)                               6 μl
    GTP (100 μM)                                                3.75 μl
    PCR                                                               400 ng
    γ32P GTP                                                       7.5 μl
    H2O                                                                to 30 μl final volume
    T7 RNA polymerase (20 U/μl)                       1.6 μl
    1. Incubate 1 h, 30 min at 37 °C.
    2. Add to the reaction mix 2 μl of RQ1 DNase (1 U/μl).
    3. Incubation 30 min at 37 °C (digestion of DNA).
    4. Precipitation with 1/10 vol 3 M NaOAc (pH 4.7) + 3 vol EtOH + 25 μg Glycogen.
    5. Centrifuge 10 min at >10,000 x g, take off EtOH and wash pellet once with 70% EtOH by inverting tube.
    6. Air-dry pellet and take up the RNA in the desired volume of H2O.

Recipes

  1. 3 M NaOAc (pH 4.7)
    Dissolve 40.8 g of sodium acetate. 3H2O in a final volume of 100 ml, adjust pH with glacial acetic acid.

Acknowledgments

This laboratory protocol is a free adaption of various published and unpublished protocols and has evolved over time. We acknowledge the support by funds from the CNRS (UPR 9073) and Univ Paris Diderot, Sorbonne Paris Cite.

References

  1. Taverniti, V., Forti, F., Ghisotti, D. and Putzer, H. (2011). Mycobacterium smegmatis RNase J is a 5'-3' exo-/endoribonuclease and both RNase J and RNase E are involved in ribosomal RNA maturation. Mol Microbiol 82(5): 1260-1276.

简介

5'末端标记的RNA分子是用于分析各种核糖核酸酶的内切和外切核酸活性的有用底物。 这里给出两个方案来合成具有5'PP或5'P部分的P sup 32标记的RNA。 5'外核糖核酸酶通常不在5'PPP RNA上起作用并且需要5'P底物。 某些内切核糖核酸酶如大肠杆菌(大肠杆菌)核糖核酸酶E或枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌 )核糖核酸酶Y可以被5'P部分刺激

关键字:RNA标记, RNA合成, 放射性标记

材料和试剂

  1. RQ1 DNA酶(Promega Corporation,目录号:M6101)
  2. 小牛肠磷酸酶(F.Hoffmann-La Roche,目录号:713023)
  3. 苯酚/Chlorophorm(1:1)(MP Biomedicals,目录号:AQUAPH01)/
    (Carlo Erba,目录号:438601)
  4. T7RNA聚合酶(Promega Corporation,目录号:P207B)
  5. T4多核苷酸激酶(Biolabs,目录号:M0201)
  6. RNasin RNA酶抑制剂(Promega Corporation,目录号:N2611)
  7. DTT(Promega Corporation,目录号:P117B)
  8. NTPs(F.Hoffmann-La Roche,目录号:set1277057)
  9. γ 32 P GTP(6,000Ci/mmole,10μC/μl)(PerkinElmer,目录号:BLU504Z)
  10. γ 32 P ATP(3,000Ci/mmole,10μCi/μl)(PerkinElmer,目录号:BLU502A)
  11. 3 M NaOAc(pH 4.7)(见配方)

设备

  1. Illustra TM MicroSpin TM G-25柱(GE Healthcare,型号:27-5325-01)

程序

  1. 5'-P RNA的合成
    1. 体外转录(30μl)
      T7 RNA聚合酶5x缓冲液         6微升
      RNasin(40U /μl)                              0.75μl
      100 mM DTT                                    3微升
      2.5 mM NTPs                                   6微升
      DNA模板(PCR片段)         400 ng
      H 2 O(不含核糖核酸酶)                           到最终体积(30μl)
      T7 RNA聚合酶(20U /μl)          1.5μl
      1. 在37℃下孵育1小时30分钟。
      2. 加入反应混合物2μlRQ1 DNA酶(1 U /μl)。
      3. 在37℃孵育30分钟(模板DNA的消化)。
      4. 放在冰上停止反应。
      5. 加入18μlH 2 O以使体积为50μl。
      6. 通过Spin-G25柱(在凝胶床上装载样品,在735×g离心2分钟(在微量离心机中〜3,000rpm))纯化RNA。
    2. 脱磷化步骤(50μl)
      小牛肠磷酸酶(CIP 1U /μl)                   2.5μl
      CIP 10x缓冲区                                                         5微升
      纯化RNA                                                            32.5微升
      H 2 O                                                                          10μl
      1. 在37℃孵育30分钟。
      2. 加入1体积苯酚/Chlorophorm(1:1),涡旋3分钟。
      3. 在> 10,000×g离心3分钟以分离各相。
      4. 沉淀上层水相,加入1/10体积。 3 M NaOAc(pH 4.7)+ 3vol。 ETOH(96%)。
      5. 在> 10,000×g离心10分钟,取出EtOH,并通过倒置管用70%EtOH洗涤沉淀一次。
      6. 风干沉淀并吸收所需体积的H 2 O中的RNA。
    3. 标记反应(20μl)
      脱磷酸化RNA                                          1微克
      T4多核苷酸激酶10x缓冲液                      2微升
      RNase抑制剂(40 U /μl)                                         0.25μl
      γsup 32 P ATP(10μCi/μl)<                                                5微升
      T4多核苷酸激酶(10 U /μl)                         1.25μl
      H 2 O                                                                         至20μl终体积
      1. 在37°C孵育2小时。
      2. 如步骤2中沉淀,并以所需体积吸收沉淀。

  2. 5'-PPP RNA的合成 T7 RNA聚合酶5x缓冲液                    6微升
    RNasin(40U /μl)                                          0.75μl
    DTT(100mM)                                             3微升
    ATP,UTP,CTP(2.5mM)                             6微升
    GTP(100μM)                                              3.75微升
    PCR                                                              400 ng
    γ 32 P GTP                                                     7.5μl
    H 2 O                                                              到30μl最终量
    T7 RNA聚合酶(20U /μl)                     1.6μl
    1. 在37℃孵育1小时,30分钟。
    2. 加入反应混合物2μlRQ1 DNA酶(1 U /μl)。
    3. 在37℃孵育30分钟(DNA的消化)。
    4. 用1/10体积的3M NaOAc(pH 4.7)+ 3vol EtOH +25μg糖原沉淀。
    5. 在> 10,000×g离心10分钟,取出EtOH,并通过倒置管用70%EtOH洗涤沉淀一次。
    6. 风干沉淀并吸收所需体积的H 2 O中的RNA。

食谱

  1. 3 M NaOAc(pH 4.7)
    溶解40.8g乙酸钠。 3H 2 O,最终体积为100ml,用冰醋酸调节pH

致谢

该实验室方案是对各种已公布和未公开的方案的自由适应,并且随着时间的推移而演变。 我们承认来自CNRS(UPR 9073)和巴黎狄德罗大学,索邦大学的资助。

参考文献

  1. Taverniti,V.,Forti,F.,Ghisotti,D.and Putzer,H。(2011)。 耻垢分枝杆菌 RNase J是5'-3'外切 - 核糖核酸酶和核糖核酸酶J和核糖核酸酶E参与核糖体RNA成熟 Mol Microbiol 82(5):1260-1276。
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Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Putzer, H. (2012). Synthesis of 5’ end-labeled RNA. Bio-protocol 2(14): e241. DOI: 10.21769/BioProtoc.241.
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Marco Binder
Dept. Infectious Diseases, Medical Faculty Heidelberg
After reading the material requirements in the top, it appears to me that one step simply has been forgotten in the protocol, which would be the phosphorylation of the CIPped RNA by polynucleotide kinase and gamma-P32-ATP. Then everything would make sense again!

:-)
10/24/2013 1:17:53 AM Reply
Harald Putzer
CNRS FRE3630, Institut de Biologie Physico-Chimique, France

Dear Marco,
you are correct, the labeling step is not in protocol even though it was in the version that I had submitted. Sorry for that. The missing part is:
3) Labelling reaction (20 µl)

Dephosphorylated RNA 1 µg
T4 Polynucleotide Kinase buffer 10X 2 µl
RNase inhibitor (40 U/µl) 0.25 µl
?32P ATP (10 µCi/µl) 5 µl?
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl) 1.25 µl
H2O to 20 µl final volume

a. incubate 2 hours at 37°C
b. Precipitation as in step (2) and take up the pellet in desired volume

I will ask to correct this on the web site.

Harald

10/24/2013 2:54:45 AM


Bio-protocol Editorial Team
bio-protocol.org

Dear Dr. Putzer and Macro,

The missing step has been added as shown at step 1c. We deeply apologize for our mistake and any confusion that have caused to you.

Sincerely,
Bio-protocol editing team

10/24/2013 10:50:43 PM


Marco Binder
Dept. Infectious Diseases, Medical Faculty Heidelberg
I do not understand, how CIP treatment would generate a 5'-monophosphate; from what I understand, CIP removes ALL phosphoryl-groups from DNA, RNA and protein...
10/24/2013 12:31:19 AM Reply