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Primer Extension Analysis Using AMV Reverse Transcriptase
使用AMV逆转录酶进行引物延伸分析   

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本文章节

Abstract

Primer extension analysis is a useful method to determine the transcription start point or a processing site on an RNA molecule. It can also allow a quantitative measurement of an RNA species.

Keywords: 5' end mapping(5’端映射), Reverse Transcription(反转录), Primer extension(引物延伸)

Materials and Reagents

  1. AMV reverse transcriptase from the avian myeloblastosis virus (Finnzyme, catalog number: F570 ) (other reverse transcriptases can also be used, by adapting the reaction buffer)
  2. T4 polynucleotide kinase + 10x reaction buffer (Biolabs, catalog number: M0201 )
  3. RNasin Plus RNase inhibitor (Promega Corporation, catalog number: N2611 )
  4. Glycogen (Acros organics, catalog number: 422950010 )
  5. NaCl 
  6. Tris-HCl (pH 7.5) 
  7. EDTA
  8. MgCl2
  9. EtOH
  10. dATP,dCTP,dGTP,dTTP (Promega Corporation, catalog number: U120D , U121D , U122D , U123D )
  11. γ-32P ATP (3,000 Ci/mmole, 10 μCi/μl) (PerkinElmer, catalog number: BLU502A )
  12. DTT (Promega Corporation, catalog number: P117B )
  13. 5x ss-Hybridization buffer (see Recipes)
  14. 1.25x RT buffer (see Recipes)

Equipment

  1. Incubator

Procedure

  1. Primer labelling
    1. Labelling mix (total volume 10 μl):
      1. 1 μl oligonucleotide (20-25 mer, 10 pmoles/μl)
      2. 3.5 μl γ32P ATP (10 μCi/μl)
      3. 1 μl T4 DNA polynucleotide kinase
      4. 1 μl 10x polynucleotide kinase reaction buffer
      5. 3.5 μl H2O
    2. Incubate 30 min at 37 °C, stop reaction on ice.

  2. Precipitation
    1. Add 1/10 vol 10 M LiCl.
    2. Add 3 vol EtOH (96 %).
    3. Incubate 30 min at -80 °C.
    4. Centrifuge 20 min at >10,000 x g at room temperature (RT), take off supernatant, don't wash.
    5. Air-dry pellet and take up in 10 μl (consider concentration to be 0.5 pmoles/μl).

  3. Annealing step
    1. Annealing mix (total volume 10 μl):
      1. 10 - 20 μg total RNA
      2. 10 U RNasin RNase inhibitor
      3. 0.5 pmole of 5' labelled primer (1 μl)
      4. 2 μl 5x ss-hybridization buffer
      5. Add water to 10 μl.

  4. Extension step
    1. Add directly to the annealing mix:
      1. 40 μl 1.25x RT buffer (pre-warmed at 50 °C)
      2. 10 U AMV transcriptase
      3. 10 U RNasin inhibitor
    2. Incubate 30 min at 50 °C (extension).

  5. Extension termination
    1. Add to the reaction mix:
      1. 1 μl EDTA (0.5 M)
      2. 6 μl NaOH (1 M)
    2. Incubate 10 min at 55 °C.
    3. Add 6 μl HCl (1 M) (neutralization).

  6. Precipitation
    1. Add 1/10 vol 10 M LiCl.
    2. Add 25 μg glycogen.
    3. 2.5 vol EtOH.
    4. Incubate at -20 °C for > 1 h.
    5. Centrifuge 10 min at >10,000 x g at room temperature, wash pellet 1x with 70% EtOH.
    6. Air-dry pellet and take up in 15 μl of classic DNA Loading dye buffer.

  7. Separation of reaction products on denaturing polyacrylamide gel.

Recipes

  1. 5x ss-Hybridization buffer
    1.5 M NaCl 
    50 mM Tris HCl (pH 7.5) 
    10 mM EDTA
  2. 1.25x RT buffer 
    1.25 mM dATP 
    1.25 mM dCTP 
    1.25 mM dGTP 
    1.25 mM dTTP
    12.5 mM DTT
    12.5 mM Tris HCl (pH 8)
    7.5 mM MgCl2

Acknowledgments

This laboratory protocol is a free adaption of various published and unpublished protocols and has evolved over time. We acknowledge the support by funds from the CNRS (UPR 9073) and Univ Paris Diderot, Sorbonne Paris Cite.

References

  1. Taverniti, V., Forti, F., Ghisotti, D. and Putzer, H. (2011). Mycobacterium smegmatis RNase J is a 5'-3' exo-/endoribonuclease and both RNase J and RNase E are involved in ribosomal RNA maturation. Mol Microbiol 82(5): 1260-1276.

简介

引物延伸分析是确定RNA分子上的转录起始点或加工位点的有用方法。 它还可以允许RNA物质的定量测量。

关键字:5’端映射, 反转录, 引物延伸

材料和试剂

  1. 来自禽成髓细胞淋巴瘤病毒(Finnzyme,目录号:F570)的AMV逆转录酶(也可以使用其它逆转录酶,通过适应反应缓冲液)
  2. T4多核苷酸激酶+ 10x反应缓冲液(Biolabs,目录号:M0201)
  3. RNasin Plus RNase抑制剂(Promega Corporation,目录号:N2611)
  4. 糖原(Acros organics,目录号:422950010)
  5. NaCl
  6. Tris-HCl(pH 7.5) 
  7. EDTA
  8. MgCl 2
  9. EtOH
  10. dATP,dCTP,dGTP,dTTP(Promega Corporation,目录号:U120D,U121D,U122D,U123D)
  11. γ-32P ATP(3,000Ci/mmole,10μCi/μl)(PerkinElmer,目录号:BLU502A)
  12. DTT(Promega Corporation,目录号:P117B)
  13. 5x ss-杂交缓冲液(见配方)
  14. 1.25x RT缓冲液(见配方)

设备

  1. 孵化器

程序

  1. 引物标记
    1. 标记混合物(总体积10μl):
      1. 1μl寡核苷酸(20-25mer,10 pmoles /μl)
      2. 3.5μlγ32PATP(10μCi/μl)
      3. 1μlT4 DNA多核苷酸激酶
      4. 1μl10x多核苷酸激酶反应缓冲液
      5. 3.5μlH 2 O
    2. 在37℃孵育30分钟,在冰上停止反应
  2. 沉淀
    1. 加入1/10体积的10M LiCl。
    2. 加入3vol EtOH(96%)。
    3. 在-80℃下孵育30分钟
    4. 在室温(RT)下以> 10,000×g离心20分钟,取出上清液,不洗涤。
    5. 空气干燥沉淀并吸收10μl(考虑浓度为0.5 pmoles /μl )。 />

  3. 退火步骤
    1. 退火混合物(总体积10μl):
      1. 10-20μg总RNA
      2. 10 U RNasin RNA酶抑制剂
      3. 0.5pmole 5'标记的引物(1μl)
      4. 2μl5x ss-杂交缓冲液
      5. 加水至10μl。

  4. 扩展步骤
    1. 直接加入退火混合物:
      1. 40μl1.25x RT缓冲液(在50℃预热)
      2. 10 U AMV转录酶
      3. 10 U RNasin抑制剂
    2. 在50°C孵育30分钟(延伸)。

  5. 扩展终止
    1. 加入到反应混合物中:
      1. 1μlEDTA(0.5M)
      2. 6μlNaOH(1M)
    2. 在55°C孵育10分钟。
    3. 加入6μlHCl(1M)(中和)
  6. 沉淀
    1. 加入1/10体积的10M LiCl。
    2. 加入25μg糖原。
    3. 2.5vol EtOH。
    4. 在-20℃下孵育> 1小时。
    5. 在室温下以> 10,000×g离心10分钟,用70%EtOH洗涤沉淀1次。
    6. 空气干燥颗粒,并吸收15μl的经典DNA加载染料缓冲液
  7. 在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离反应产物

食谱

  1. 5x ss-杂交缓冲液
    1.5 M NaCl
    50 mM Tris HCl(pH 7.5)<
    10 mM EDTA
  2. 1.25x RT缓冲区
    1.25 mM dATP 
    1.25 mM dCTP 
    1.25 mM dGTP 
    1.25 mM dTTP
    12.5 mM DTT
    12.5mM Tris HCl(pH8)
    7.5 mM MgCl 2 />

致谢

该实验室方案是对各种已公布和未公开的方案的自由适应,并且随着时间的推移而演变。 我们承认来自CNRS(UPR 9073)和巴黎狄德罗大学,索邦大学的资助。

参考文献

  1. Taverniti,V.,Forti,F.,Ghisotti,D.and Putzer,H。(2011)。 耻垢分枝杆菌 RNase J是5'-3'外切 - 内切核糖核酸酶和RNase J和RNase E都参与核糖体RNA成熟。 82(5):1260-1276。
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Copyright: © 2017 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Putzer, H. (2012). Primer Extension Analysis Using AMV Reverse Transcriptase. Bio-protocol 2(14): e240. DOI: 10.21769/BioProtoc.240.
提问与回复

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