材料和试剂

玻璃毛细丝（NARISHIGE，目录号：GDC-1）
24 x 55毫米封面玻璃（松本玻璃，目录号：C024551）
76 x 26毫米玻璃片（松本玻璃，目录号：S011110）
18×18毫米玻璃盖（厚度0.16-0.19毫米; 1S/1.5号）（松本玻璃，特殊订购产品）
微铲（例如，，AS ONE，目录号：6-524-01）
1.5ml棕色管（例如，FUKAEKASEI，WATSON，目录号：131-915BR）
铝箔（例如UACJ箔公司）
注射器驱动膜过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGS033SS）
19（W）×0.18（T）mm乙烯胶带（3M，目录号：35-WHITE-3/4）
无绒擦拭（KCWW，Kimwipes，目录号：S-200）
暗室（例如，，Ina-optika，型号：FB-35BL）
注意：我们在内盖上形成大约7×10.5厘米的矩形孔。
N2野生型C。 elegans
用于显微注射的琼脂糖凝胶垫

Agarose-LE，经典型（Nacalai Tesque，目录号：01157-66）
或琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：15510-027）
注意：本产品已停产。

液体石蜡（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-00476）
0.10微米聚苯乙烯微球悬浮液（Polysciences，目录号：00876-15）
注意：

在1.5 ml管中准备大约500μl等分试样
存储在4°C

盐酸5-羟色胺（Sigma-Aldrich，目录号：H9523）
钙绿1葡聚糖，钾盐，10,000MW阴离子（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{，目录号：C3713）}
无核酸酶水（Promega，目录号：P1193）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（和光纯药，目录号：169-04245）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（和光纯药，目录号：197-02865）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（和光纯药，目录号：131-00405）
NuSieve GTG琼脂糖（Lonza，目录号：50080）
凡士林（白凡士林）（Kozakai Pharmaceutical）
羊毛脂（Sigma-Aldrich，目录号：L7387）
石蜡颗粒（例如，Seiwa）
D（+） - 葡萄糖（Wako Pure Chemical Industries，目录号：041-00595）
注意：本产品已停产。
0.2％BSA-荧光素溶液（溶于不含核酸酶的水中）
注意：使用前请先准备好。
2.0％明胶溶液
BSA-荧光素（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：A23015）}
100μM钙绿葡聚糖溶液（参见食谱）
灭菌的1M MgSO 4溶液（参见食谱）
M9缓冲区（见配方）
10％NuSieve GTG琼脂糖/M9垫（见食谱）
VALAP（见配方）
注射液回收溶液（参见食谱）
20 mg/ml盐酸羟色胺/M9缓冲液（见配方）
荧光参考幻灯片（见配方）

设备

拔针器（NARISHIGE，型号：PC-10）
微量注射器（Eppendorf，型号：FemtoJet Microinjector）
具有操纵器的倒置显微镜（例如，Leica Microsystems，型号：DMIRB; NARISHIGE型号：MMO-220A，MO-202U，MN-4）
热板（例如，IKA，目录号：C-MAG HP7）
微波炉（例如，松下，型号：NE-EH212）
注意：本产品已停产。
显微镜（例如，Leica Microsystems，型号：DMRE; Nikon Instruments，型号：Ti-E）
50毫升螺旋盖玻璃瓶（例如，AS ONE，目录号：1-4568-01）
100ml烧杯（例如，ASAHI Glass，AGC，目录号：1000BK100）
50ml烧杯（例如，ASAHI Glass，AGC，目录号：1000BK50）
钻石笔（例如，，Ogura Jewel Industry，型号：D点笔）
高倍率水浸物镜（例如，Leica Microsystems，型号：HCX PL Apo 63x/1.20W corr; Nikon Instruments，型号：Plan Apo VC 60XA/1.20W）
旋转盘共焦单元（横河电机，型号：CSU-X1）
EM-CCD摄像头（Andor Technology，型号：iXon DU-897）
Ar/Kr激光（IDEX，Melles Griot，型号：643-YB-A01）
过滤器/快门控制器（Ludl Electronic Products，型号：Mac 6000，目录号：73006081,73006042,73006001）
488nm激光线滤波器（IDEX，Semrock，目录号：LL01-488）
分色镜（IDEX，Semrock，目录号：Di01-T488）
长通屏障滤波器（IDEX，Semrock，目录号：BLP01-488R）
用于图像采集的Windows 7计算机
用于图像处理的Mac计算机（例如，，10.6.8或更高版本）
互动笔显示（Wacom，型号：Cintiq 21UX）

软件

ImageJ（版本1.49v或更新版本）（ https：//imagej。 nih.gov/ij/download.html ）
图像采集软件（例如，，Andor Technology，iQ [ver.1.10.3或更高版本]或iQ2 [ver.2.9.1或更高版本]）

程序

注意：该协议是从Samuel等人描述的原始方法进行修改的。（2001）。

显微注射化学钙指示剂染料
1. 通过使用标准方法将100μM钙绿葡萄糖溶液注入妊娠成年雌雄同体前生殖系的远端臂。 elegans DNA显微注射（参见Evans，2006）。我们使用GDC-1玻璃毛细管，双拉模式下由PC-10拉拔器拉出的细丝。此外，我们在24 x 55 mm的玻璃上使用2％或3.5％琼脂糖凝胶垫进行蠕虫固定和液体石蜡，以保护样品免受干燥。
  注意：
  1. 如Samuel等人所述，填满大约一半的性腺（2001）。注射过多的染料经常会导致恢复后的性腺异常异常。
  2. 我们总是每个琼脂糖垫只放置一个蠕虫进行注射，以最大限度地减少蠕虫固定的时间，从而最大限度地减少损伤。
  3. 我们通常在一组实验（例如一种基因型）中注射四至六个蠕虫，并在一天内进行两组实验，间隔为2小时。大约一半的注射蠕虫可以对每组实验进行成像。
2. 要恢复注射的蠕虫，使用P20微量移液管将大约1μl的注射液回收溶液涂抹在蠕虫上
3. 通过使用P20微量吸管，将注射的蠕虫吸入注射液回收溶液中，并将其从琼脂糖垫转移到3.5厘米的OP50/NGM板上。
  注意：从采摘到转移的单次注射程序（步骤A1-A3）应在约5分钟内完成。
4. 允许注射的蠕虫在室内的黑暗室中恢复4-6小时。
5. 使用立体荧光显微镜检查注射的染料是否并入蠕虫的卵母细胞注意：Sloppy注射可能导致染料渗入细胞中（Samuel et al。，2001）。
蠕虫准备和成像
注意：蠕虫固定方法从Kim等人描述的原始方法进行了修改。（2013）。
1. 熔化VALAP在130°C的热板上。
2. 准备10％琼脂糖凝胶垫。
  1. 准备两个双层玻片（图1A）。该图像中的磁带堆叠厚度为0.36 mm
  2. 在微波炉中将10％NuSieve GTG琼脂糖/M9缓冲液熔化。
  3. 通过使用微型刮刀将一滴熔化的10％NuSieve GTG琼脂糖/M9缓冲液施加到两个胶带玻片之间的载玻片上（图1A;视频1）。
  4. 用另一张玻璃片盖住熔化的琼脂糖滴（图1B;视频1）。
  5. 在室温下孵育至少30分钟以固化琼脂糖垫。保持玻璃片覆盖的琼脂糖垫直到使用。
    
    图1.样品制备A.将一滴10％琼脂糖通过使用微型刮刀施加到两个双层隔片之间的载玻片上。 B.将载玻片放在10％琼脂糖滴上。 C.将一滴微球悬浮液和一滴血清素/M9溶液施加到立体显微镜台上的琼脂糖垫上。 D.准备成像的样品，其中玻璃板上的VALAP在琼脂糖垫上稳定（未注射的蠕虫固定在该图像中）。
    
    Video 1. Preparation of a 10% agarose gel pad
3. 允许聚苯乙烯微球悬浮液和盐酸5-羟色胺/M9缓冲液在使用前在室温下保温至少30分钟。
4. 检查注射的蠕虫的卵母细胞的形状，使用立体荧光显微镜确定排卵的时间。前卵母细胞的形状应呈矩形，其核应位于精子细胞远端的皮层区域（图2）。
  
  图2.基于卵母细胞形状推断排卵时间。A.在几分钟内出现准备排卵的卵母细胞。卵母细胞形状是矩形的，面向下一个卵母细胞的边界看起来像一条直线（由黑线表示），并且细胞核靠近精子细胞远端的皮层区域。 B.卵母细胞未准备成像。边界具有弧形外观（由黑线表示），细胞核不靠近远端皮层。显示非注射野生型蠕虫的差分干涉对比图像。图像被翻转成与图3中的共聚焦显微镜图像相同的方向。箭头指示细胞核。绘制黑线以强调边界。比例尺=20μm。
5. 取出覆盖琼脂糖垫的玻片，将0.5微升的0.10微米聚苯乙烯微球悬浮液加到琼脂糖垫的中心（视频2）。
  
  Video 2. Worm-immobilization
6. 在琼脂糖垫上的聚苯乙烯微球悬浮液中加入0.5μl20mg/ml的羟色胺盐酸盐/M9缓冲液（图1C; Video 2）。据信，血清素促进受精（Samuel等人，2001）。
  注意：
  1. 不要预先混合聚苯乙烯微球和5-羟色胺，因为混合导致微球聚集。
  2. 虽然我们通常使用5-羟色胺，但并不是必需的，我们已经观察到没有血清素固定的蠕虫中的正常排卵和受精（Takayama和Onami，2016）。
7. 通过使用蠕虫选择（视频2），将距离3.5厘米OP50/NGM板几分钟内排卵的蠕虫转移到琼脂糖垫上的下降。
8. 通过使用蠕虫选择来排列蠕虫的方向，使得具有注射的染料的卵母细胞将位于盖玻片的正下方。由于前和后性腺的不对称构型，通常只有一个近端性腺位于护罩玻璃下方。
9. 轻轻地将18 x 18毫米的盖玻片放在琼脂糖垫上（视频2）。
10. 通过使用P20微量移液器（图1D;视频2），通过在玻璃杯的四个角落涂上四滴熔化的VALAP来稳定玻璃罩。
11. 将样品载玻片放在旋转盘共聚焦显微镜上
12. 通过使用低倍率物镜（例如，10x或20x）来查找蠕虫。
13. 使用高放大倍率的浸水式物镜设置最佳捕获精母细胞中预期能够对卵母细胞施肥的主要精子的视场和焦平面。
14. 当蠕虫开始排卵时开始延时记录。 2D延时成像的典型延时设置如下：曝光178.6毫秒;相机合并，2;时间间隔0.2秒（最快）;和持续时间，6分钟。对于3D延时成像，典型设置如下：曝光50毫秒;相机合并，2;时间间隔1.0秒;持续时间6分钟; z平面间隔，1μm;和z平面的数量12.设置EM增益使得图像的强度将在预定义的范围内（例如，对于12位，为0-4,095）。 >
15. 将图像保存为16位多图像文件。
16. 通过使用荧光参考幻灯片捕获不均匀照明校正的荧光参考图像。我们通常在前景的蛋白质胶片区域捕获至少40个不同的图像，在14位范围内捕获5种不同的图像（0-16,383）。

数据分析

安装用于图像处理的插件
1. 从 https://imagej.nih.gov/ij下载并安装ImageJ /download.html 。
2. 从 https：//imagej。下载并安装mbf-plugins.zip。 nih.gov/ij/plugins/mbf/，其中包含BG_Subtraction_from_ROI插件。
3. 下载（编译）并从 http： //so.qbic.riken.jp/cawave/index.html ：
  1. Calculator_Plus3.java（Calculator_Plus3.class）
  2. ContourTrack3Stack_.java（ContourTrack3Stack_.class）
  3. Layer_Test2M.java（Layer_Test2M.class，Layer_Test2M $ LayeredImageM.class）
  4. ContourTrack4Stack_.java（ContourTrack4Stack_.class）
  5. TrackOocyte_.java（TrackOocyte_.class，LabelHolder.class）
  6. RoughQuantify_.java（RoughQuantify_.class）
图像处理以校正不均匀照明
注意：
1. 用于不均匀照明校正的协议由Wolf等人描述的原始方法进行修改。（2007）。
2. 下面描述的过程也被视为视频（视频3）。
  
  Video 3. Image processing of the reference image to correct for uneven illumination
1. 使用/Image/Adjust/Brightness/Contrast功能和Image/Type/8-bit功能，将16位tiff图像从0-16,383（14位范围）线性转换为8位。
2. 通过使用Image/Stack/ZProject ...功能的平均强度投影操作，平均前景图像（荧光参考幻灯片中蛋白质膜区域的40张图像）。生成的文件是平均的前景图像。
3. 通过使用Image/Stack/ZProject ...功能的平均强度投影操作来平均背景图像（荧光参考幻灯片中的蛋白质膜外部的5个图像）。生成的文件是平均的背景图像。
4. 通过使用Calculator_Plus插件的减法操作，从平均的前景图像中减去平均的背景图像。打开平均的前景图像和平均的背景图像，启动Calculator_Plus插件，选择平均的前景图像为i1，平均的背景图像为i2，选择"减法"，然后单击"确定"按钮。生成的图像文件是参考图像。
用于量化时间过程的图像处理。
注意：
1. 原始数据呈现于高山和Onami（2016）。示例图像文件可以从 SSBD数据库（Tohsato et al。，2016）
2. 下面描述的整个过程也被呈现为五个视频（视频4-8）。
1. 通过使用/Image/Adjust/Brightness/Contrast功能和Image/Type/8-bit功能，将16位多Tiff图像堆栈线性转换为8位多图形图像堆栈。取决于图像的强度范围，我们通常使用0-2,047（11位），0-4,095（12位），0-8,191（13位）或0-16,383（14位）的范围，并将其转换到0-255（8位）。
  
  Video 4. Conversion to an 8-bit image stack, background subtraction, and uneven illumination correction (steps C1-C3)
2. 通过目视检查卵母细胞尖端的形态变化来确定精子入口的时间片数（图3）。时间片T-1 定义为时间0片。
  注意：卵母细胞突然突出是精子进入的标志。执行3D延时成像时，也可以确定精子输入的z切片。
  
  图3.精子进入时卵母细胞尖端的形态学变化在整个视野（AD）和相应的放大区域（EH）中受精期间卵母细胞形状的延时图像由图A中的白盒指示。图C，D，G和H中的箭头表示在精子进入时卵母细胞尖端突然突出，因此切片＃99被定义为时间0切片。面板A和E中的比例尺为10μm。
3. （可选）切出（1）-50秒之前的时间片段，（2）超过300秒的时间片段，因为它们没有关于受精钙波的相关信息。
4. （可选）通过使用Deinterleave功能，缩短时间片以便于以8片段间隔进行图像处理。使用包含时间0片的图像堆栈进行后续分析。
  
  Video 5. Determination of the time 0 slice, cutting slices (earlier than -19.6 sec and later than 250.2 sec in this video), and thinning of the image series (steps C4-C6)
5. 使用/Image/Adjust/Threshold功能进行黑白图像叠加。应将上限阈值设置为255，将下限阈值设置为最好将卵母细胞区域与背景区分开的值。通过图像堆栈使用较低的阈值。检查黑色背景复选框。所产生的图像堆栈是黑白图像堆栈。
6. 使用ContourTrack3Stack_插件去除小碎片区域（图4）。打开黑白图像堆栈，启动ContourTrack3Stack_插件，并输入要删除的区域（像素）的上限值。典型的输入值为2,000，这意味着删除面积小于2,000 x 0.9 = 1,800的前景区域。所得到的图像堆栈是碎片去除的黑白图像堆栈。
  
  图4. ContourTrack3Stack_插件。 A.打开的黑白图像堆栈以及ContourTrack3Stack_插件的输入窗口。 B.生成的图像文件不包含碎片区域。
7. 用人眼检查分段卵母细胞区域的形状。
  注意：通常，排卵前的卵母细胞不能从其他卵母细胞或远端性腺分裂（图4B）。
  
  Video 6. Conversion to a black-white image stack and removal of debris (steps C7-C9)
8. 使用Layer_Test2M插件手动更正分割（图5）。启动Layer_Test2M插件，单击打开按钮，选择标准化的8位图像堆栈作为背景层，并选择碎片去除的黑白图像堆栈作为前景层。通过单击删除复选框绘制或删除，并使用笔工具和交互式笔显示来手动更正分割。所产生的黑白图像堆栈是手动校正的黑白图像堆栈。
  注意："保存"按钮将会将结果保存为单个tiff文件的顺序，而/File/Save as/Tiff ...功能会将映像堆栈保存为多tiff文件。
  
  图5. Layer_Test2M插件。 A. Layer_Test2M插件的窗口; B.分层图像堆栈，其中半透明红色前景图像分层到背景图像上。
  
  Video 7. Manual correction of the segmented region (step C10)
9. 通过使用ContourTrack4Stack_插件，除去分割的卵母细胞区域之外的前景区域（图6）。打开手动校正的黑白图像堆栈，启动ContourTrack4Stack_插件，并输入卵母细胞区域（像素）的近似值。典型的输入值为6000，这意味着去除区域小于6,000 x 2/3 = 4,000且大于6,000 x 4/3 = 8,000的前景区域。
  
  图6. ContourTrack4Stack_插件。 A.手动校正的黑白图像堆栈和ContourTrack4Stack_插件的输入窗口。 B.一个不包含远端性腺区域，但包含其他胚胎区域的图像堆栈。
10. （可选）如果图像堆栈具有卵母细胞区域以外的前景区域，请使用TrackOocyte_插件通过图像堆栈跟踪卵母细胞区域（图7）。启动TrackOocyte_插件，然后在图像堆栈的第一个时间片段单击感兴趣的卵母细胞区域。所得到的图像堆栈是跟踪的图像堆栈。
  
  图7. TrackOocyte_插件。 A.通过启动TrackOocyte_插件，然后单击卵母细胞区域（左），该区域将通过图像堆栈进行跟踪。 B.产生的TrackOocyte_插件的图像堆栈。除了点击区域以外的区域被删除。
11. 如果分段区域具有孔（分段区域中的小背景区域），则使用Process/Binary/Fill_Holes函数填充孔。所得到的图像堆栈是黑白掩模图像堆栈。
12. 通过使用Calculator_Plus3插件的Mask操作，屏蔽黑白掩模图像堆栈的归一化8位图像堆栈。打开标准化的8位图像堆栈和黑白掩模图像堆栈，启动Calculator_Plus3插件，并选择归一化的8位图像堆栈作为i1，黑白掩模图像堆栈作为i2，选择"掩码" ，然后单击确定按钮。所产生的图像堆栈是包含分段卵母细胞的被屏蔽的8位图像堆栈。
13. 使用RoughQuantify_插件量化钙荧光的时间过程（图8）。打开屏蔽的8位映像堆栈，启动RoughQuantify_插件，并输入时间0片数和间隔时间（秒）。所得到的数值数据将由切片数，分段区域的平均强度（F），时间，比值（F/F ₀），强度之和，面积分段区域，方差和强度的标准偏差。将数据保存为.xls文件以供后续分析。
  
  图8.RoughQuantify_插件。 A.屏蔽的8位映像堆栈，以及时间0片段编号和时间间隔的输入窗口。 B. RoughQuantify_插件的输出。
  
  Video 8. Segmentation, tracking, and quantification (steps C11-C15)

笔记

蠕虫固定方案可以用于在受精期间的其他细胞过程，如膜融合或细胞骨架动力学。对于膜融合成像，使用OD58 [卵母细胞GFP :: PH]菌株（Audhya等人，2005）和EG4883雄性[精子mCherry ::组蛋白]（Frøkjaer-Jensen等）（2008））或ONA18 [精子TRP-3 :: tagRFP-T]菌株（Takayama和Onami，2016），而不是野生型N 2。对于丝状肌动蛋白成像，使用BV67 [lifeact :: gfp]菌株（Pohl和Bao，2010）。

食谱

100μM钙绿葡聚糖溶液

在1.5 ml棕色管中称量"Green-1"葡聚糖粉末
将无核酸酶的水加入到1.5-ml棕色管中以制备1mM溶液注意：使用染料摩尔值计算浓度。
用无核酸酶的水将1mM溶液稀释至100μM
在-20°C的黑暗中储存为20-μl等分试样放入1.5-ml棕色管中

用于显微注射的琼脂糖凝胶垫
1. 准备2％或3.5％琼脂糖/纯水（EMD Millipore，Elix）溶液在50ml螺旋盖瓶中
2. 在24 x 55毫米的护目镜上制作琼脂垫
注意：我们分别使用Agarose-LE，经典型（Nacalai Tesque）或琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）作为2％溶液或3.5％溶液。
灭菌的1M MgSO 4溶液

将123.24g MgSO 4·7H 2 O溶解在500ml纯（Elix）水中
在121℃高压灭菌20分钟
在室温下存放

M9缓冲液

在1升纯（Elix）水中溶解以下物质 3g KH 2 PO 4
6g Na 2 HPO 4
5克NaCl
在121℃高压灭菌20分钟，然后加入1毫升灭菌的1M MgSO 4溶液
在室温下存放

10％NuSieve GTG琼脂糖垫

通过使用微量铲将1.0g NuSieve GTG琼脂糖与10ml M9缓冲液在50ml螺旋盖玻璃瓶中混合，
通过使用微波炉将NuSieve GTG琼脂糖/M9缓冲液混合物熔化
在室温下冷却10％NuSieve GTG琼脂糖/M9缓冲液混合物，使其固化
在室温下存放

VALAP

将凡士林，羊毛脂和石蜡以2：2：1（重量）的比例混合在100 ml烧杯中，
用铝箔盖住烧杯
将130℃的烧杯内容物熔化在热板上
在室温下存放

注射液回收溶液

将2 g葡萄糖溶于50ml M9缓冲液中
通过膜过滤灭菌
在1.5 ml管中准备500μl等分试样
当需要时，将5μl的2.0％明胶溶液加入到500μl等分试样中注意：添加明胶以防止蠕虫粘到尖端。
在室温下存放

20mg/ml盐酸羟色胺/M9缓冲液
1. 称量盐酸5-羟色胺在一个1.5毫升的管子
2. 将M9缓冲液加入到1.5 ml管中以制备20 mg/ml溶液
3. 准备10μl等分试样在1.5 ml管中
4. 存放在-20°C的密封袋中
注意：存放在密封袋中可防止溶液获得褐色。
荧光参考幻灯片

通过使用金刚石笔来表示荧光蛋白膜的区域，在18×18mm的盖玻璃上绘制一个圆圈（直径约5毫米）。圆的一侧是玻璃的上侧
将10μl0.2％BSA-荧光素溶液涂抹在玻璃罩上侧的圆上
在深色加湿室中孵育玻璃盖，室温下放置30分钟
将盖玻璃浸入50ml烧杯中的约40ml纯（Elix）水中以进行洗涤。用另一个大约40毫升的水重复这个洗涤步骤
用无毛巾擦拭水滴（Kimwipes）
注意：不要用擦拭物触摸蛋白质膜区域。
将盖玻片在室温下干燥
翻转并将盖玻片放在玻璃滑块上，以使盖玻璃的上侧面向玻璃片
用透明（苏格兰）胶带
密封盖玻璃的边缘
储存于-20°C，黑暗中

致谢

该协议用于高山和Onami（2016）。用于显微注射化学钙指示剂染料的方案基于Samuel等人描述的方案。（2001）。固定方法基于Kim等人的方法。（2013）。不均匀的照明校正来自Wolf等人的工作。（2007）。 Calculator_Plus3插件是由由Wayne Rasband和Gabriel Landini开发的Calculator_Plus插件修改的。 ContourTrack3Stack_，ContourTrack4Stack_和TrackOocyte_插件代码的部分由Takuya Maeda编写的程序重复使用。感谢Asako Sugimoto关于选择显微镜过滤器的建议。我们还感谢Kyji Kyoda和Rie Furushima的协助。这项工作部分得到了日本科学技术厅（SO）的国家生物科学数据库中心（NBDC），RIKEN（SO）的研发（总统自选资金）战略计划和JSPS的支持KAKENHI Grant Number 15K18547（JT）。作者宣称他们没有竞争的利益。

参考文献

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