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Cell Survival Rate Assay
细胞存活率检测   

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本文章节

Abstract

This protocol utilizes PicoGreen 96-well plate technology. This method is applied to estimate the sensitivity of different tumor cell lines to chemodrugs.

Materials and Reagents

  1. 10% FBS culture medium
  2. Chemodrugs
  3. PicoGreen (Life Technologies, Invitrogen™, catalog number: P7581 )
  4. TryLE express (Trypsin) (Life Technologies, Gibco®, catalog number: 12605-010 )
  5. Phosphate buffered saline (PBS)
  6. Deionized water

Equipment

  1. 96-Well culture plate
  2. TECAN Genios Instrument (PHENIX)
  3. Incubator
  4. Foil
  5. Spectrophotometer

Procedure

  1. Suck out medium, wash once with 5 ml PBS. Add 2 ml tryLE express. After cells become detached, add 10 ml complete medium. Pipette the cell suspension with 5-10 ml pipette to become single cell suspension. This step is very important (to get single cell suspension, put the pipette tip onto the bottom of the flask, then push out the cell suspension through squeezing the cell suspension out of pipette).
  2. Count the cells and dilute to 1 x 10/ml, place cells in 96-well plate in 100 μl (1 x103/well).
  3. Interested medication was diluted in a series of concentrations and was added in wells in 100 μl (the medication was prepared in 2 times of final concentration).
  4. Put the plate in 37 °C, 5% CO2 for 1 week.
  5. Remove media from plate by shaking the plate in sink. Then tap on towel to remove the remaining of media.
  6. Wash with PBS 200 μl/well twice. Remove PBS by shaking plate. Tap plate on towel.
  7. Add 100 μl deionized water to each well. Place the plate in incubator 37 °C, 5% CO2 for 1 h.
  8. Dilute PicoGreen in deionized water 1:200 (will need 100 μl/well). Make sure to calculate how much you will need. Wrap the plate with foil and let sit for 1 h at RT (this step can be done overnight if you are busy).
  9. Measure the plate with spectrophotometer for fluorescence intensity.
  10. Process the data:
    Survival Rate =
    Average fluorescence intensity in experimental wells x 100%
    Average fluorescence intensity in control wells
    Note: PicoGreen is a fluorochrome that selectively binds dsDNA and has characteristics similar to that of SYBR-Green I. It has a maximum excitation at 480 nm and emission at 520 nm.

Acknowledgments

This protocol was adapted from Ahn et al. (1996) and Enger (1996).

References

  1. Ahn, S. J., Costa, J. and Emanuel, J. R. (1996). PicoGreen quantitation of DNA: effective evaluation of samples pre- or post-PCR. Nucleic Acids Res 24(13): 2623-2625.
  2. Enger, O. (1996). Use of the fluorescent dye PicoGreen for quantification of PCR products after agarose gel electrophoresis. Biotechniques 21(3): 372-374.

简介

该协议使用PicoGreen 96孔板技术。 该方法用于估计不同肿瘤细胞系对化学药物的敏感性。

材料和试剂

  1. 10%FBS培养基
  2. 化学药品
  3. PicoGreen(Life Technologies,Invitrogen TM,目录号:P7581)
  4. TryLE express(胰蛋白酶)(Life Technologies,Gibco ,目录号:12605-010)
  5. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
  6. 去离子水

设备

  1. 96孔培养板
  2. TECAN Genios仪器(PHENIX)
  3. 孵化器

  4. 分光光度计

程序

  1. 取出培养基,用5ml PBS洗涤一次。 加入2ml tryLE express。 细胞脱离后,加入10ml完全培养基。 吸管用5-10毫升吸管细胞悬液成为单细胞悬液。 这一步是非常重要的(获得单细胞悬浮液,将移液器吸头放在烧瓶底部,然后通过挤出细胞悬液从移液管推出细胞悬液)。
  2. 计数细胞并稀释至1×10 3/ml,将细胞置于96孔板中,在100μl(1×10 3 /孔/孔)中。
  3. 将感兴趣的药物稀释成一系列浓度,并以100μl(以最终浓度的2倍制备药物)加入孔中。
  4. 将板置于37℃,5%CO 2下1周
  5. 通过摇动板中的水槽中的介质从板中删除。 然后点击毛巾以清除剩余的介质。
  6. 用PBS200μl/孔洗涤两次。 通过摇动板除去PBS。 在毛巾上点击板。
  7. 向每个孔中加入100μl去离子水。 将板在孵育器中37℃,5%CO 2下1小时
  8. 稀释PicoGreen在去离子水1:200(将需要100微升/井)。 确保计算你需要多少。 用箔包装板,并放置在室温下1小时(如果你忙,这一步可以在一夜之间完成)。
  9. 用分光光度计测量板的荧光强度。
  10. 处理数据:
    存活率=
    实验井中的平均荧光强度x 100%
    对照孔中的平均荧光强度为
    注意:PicoGreen是一种选择性结合dsDNA的荧光染料,具有与SYBR-Green I类似的特性。它在480 nm处具有最大激发,在520 nm处具有发射。

致谢

该方案改编自Ahn等人(1996)和Enger(1996)。

参考文献

  1. Ahn,S.J.,Costa,J。和Emanuel,J.R。(1996)。 PicoGreen DNA定量:PCR前后有效评估样品。 em> Nucleic Acids Res 24(13):2623-2625。
  2. Enger,O。(1996)。 使用荧光染料PicoGreen在琼脂糖凝胶电泳后定量PCR产物。 em> Biotechniques 21(3):372-374。
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Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Liu, F. (2012). Cell Survival Rate Assay. Bio-protocol 2(12): e216. DOI: 10.21769/BioProtoc.216.
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