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In vitro Dephosphorylation Assay of c-Myc
c-Myc体外去磷酸化实验   

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本文章节

Abstract

This protocol describes experimental procedures for in vitro dephosphorylation assay of human protein c-Myc. This protocol can be adapted to detect phosphatase activity of other Ser/Thr phosphatases.

Keywords: Dephosphorylation(去磷酸化), c-Myc(c-Myc), SCP1(SCP1)

Background

Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 1 (SCP1, also known as CTDSP1 or NLI-IF) belongs to the FCP/SCP phosphatase family and was originally reported to dephosphorylate the C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II (Yeo et al., 2003). Smad2, 3 (Wrighton et al., 2006), Snail (Wu et al., 2009), PML (Lin et al., 2014), and c-Myc (Wang et al., 2016) have also been identified as substrates of SCP1.

Materials and Reagents

  1. 1.5 ml Eppendorf tubes
  2. 50 ml tube
  3. 100 mm dish
  4. E. coli cells
  5. HKE293T cell
  6. HA-c-Myc plasmid
  7. LB medium
  8. IPTG
  9. Glutathione sepharose 4B (GE Healthcare, catalog number: 17075601 )
  10. Glycerol (Sigma-Aldrich, catalog number: G5516 )
  11. PierceTM BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Thermo ScientificTM, catalog number: 23225 )
  12. Lipofectamine 2000
  13. c-Myc antibody (Abcam, catalog number: ab32072 )
  14. Protein A/G beads (Santa Cruz Biotechnology, catalog number: sc-2003 )
  15. BSA
  16. Coomassie blue R250 (Sigma-Aldrich, catalog number: 27816 )
  17. c-Myc Ser62 phosphorylation antibody ([Abnova, catalog number: MAB6763 ] or [Abcam, catalog number: ab78318 ])
  18. Sodium hydroxide (NaOH) (Sigma-Aldrich, catalog number: 221465 )
  19. Sodium chloride (NaCl) (Sigma-Aldrich, catalog number: S7653 )
  20. Potassium chloride (KCl)
  21. Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)
  22. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)
  23. Tris base (C4H11NO3) (Sigma-Aldrich, catalog number: T1503 )
  24. EDTA (Sigma-Aldrich, catalog number: E5134 )
  25. Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: X100 )
  26. Phenylmethanesμlfonyl fluoride (PMSF) (C7H7FO2S) (Sigma-Aldrich, catalog number: P7626 )
  27. cOmplete protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, catalog number: 04693116001 )
  28. Dithiothreitol (DTT) (Sigma-Aldrich, catalog number: D0632 )
  29. PhosSTOP tablet (Roche Diagnostics, catalog number: 04906845001 )
  30. β-mercaptoethanol
  31. Bromophenol blue
  32. Sodium dodecyl sulfate (SDS)
  33. Magnesium chloride (MgCl2) (Sigma-Aldrich, catalog number: 449172 )
  34. L-Glutathione reduced (Sigma-Aldrich, catalog number: G4251 )
  35. Phosphate-buffered saline (PBS) (see Recipes)
  36. IP lysis buffer (see Recipes)
  37. Phosphatase reaction buffer (see Recipes)
  38. 5x SDS loading dye (see Recipes)
  39. GST elution buffer (see Recipes)

Equipment

  1. 250 ml flask
  2. Shaker
  3. Cell scraper
  4. Incubator
  5. Centrifuges

Procedure

  1. Heterologous expression and purification of phosphatase
    1. Inoculate a single colony of E. coli cells containing the GST-vector, GST-SCP1-WT (wild type) or GST-SCP1-DN (dominant-negative) plasmid into 10 ml LB medium and grow overnight (ON) at 37 °C.
    2. Transfer 2 ml of ON culture to a 250 ml flask containing 48 ml of LB medium.
    3. Incubate at 37 °C in a shaker at 200 rpm until OD600 reaches to 0.5. Induce with IPTG at a final concentration of 1 mM for 4 h.
    4. Transfer the cell culture into a 50 ml tube.
    5. Spin down at room temperature for 5 min, 3,000 x g to collect cells.
    6. Discard supernatant, wash the cell pellet once with 1x PBS.
    7. Resuspend the cell pellet in 500 μl IP lysis buffer without phosSTOP and then put the 50 ml tube on ice for 30 min. Vortex for 15 sec every 10 min.
    8. Spin at 20,000 x g for 10 min at 4 °C. Collect the supernatant into a new Eppendorf tube.
    9. Prepare a 50% (v/v) slurry of glutathione sepharose 4B in lysis buffer, and add 50 μl of slurry to the supernatant. Rotate for 1 h at 4 °C.
    10. Collect the beads by spinning at 1,000 x g for 1 min at 4 °C. Discard the supernatant and wash the beads 3 times with 1x PBS. Store in 1 beads volume of PBS supplemented with 10% glycerol at 4 °C if not going on to the next step immediately.
    11. To elute GST protein from beads, add 1 bead volume of GST elution buffer, vortex for 10 min at 4 °C. Collect supernatant, repeat one more time, and combine the supernatants. Use BCA Protein Assay Kit to quantify the concentration of protein.
  2. Expression and purification of phosphorylated c-Myc
    1. Transfect HKE293T cells (at a density of 1.5 x 106 in a 100 mm dish) with 5 µg of HA-c-Myc plasmid using Lipofectamine 2000.
    2. Harvest the cells in 1 ml of 1x PBS by using a cell scraper after a 36-48 h incubation.
    3. Collect the cell pellet by spinning at 1,000 x g for 1 min at 4 °C.
    4. Discard the supernatant, and lyse the cells in 500 µl lysis buffer on ice for 30 min.
    5. Collect the lysate by spinning at 12,000 x g for 15 min at 4 °C, and then transfer the cell lysate into a new Eppendorf tube.
    6. Use 1 μg of c-Myc antibody to immunoprecipitate HA-c-Myc protein from 1 mg/500 μl HEK293T cell lysate. Gently rotate for 1 h at 4 °C.
    7. Wash protein A/G beads 3 times with IP lysis buffer. Add 30 μl (60 μl 50% slurry) to the cell lysate (step 2d) and rotate for 1 h at 4 °C.
    8. Collect the beads by spinning at 1,000 x g for 1 min at 4 °C. Wash 3 times with 0.5 ml ice-cold IP lysis buffer.
    9. Store the beads in 1 bead volume of PBS supplemented with 10% glycerol on ice before use.
    10. Pick 5 µl solution and 1 µg BSA to run SDS-PAGE gel, and stain the gel with Coomassie blue, using 1 µg BSA as control, to determine HA-c-Myc immunocomplex concentration.
  3. Dephosphorylation assay
    1. Add the 0.1 µg HA-c-Myc, with 0.5 μg of bacterially-expressed GST-vector, GST-SCP1-WT (wild-type) or GST-SCP1-DN (dominant-negative) in 50 μl phosphatase buffer.
    2. Incubate the mixture at 37 °C for 30 min.
    3. Add 1 bead volume of 2x SDS loading buffer into the mixture. Stop the phosphatase reaction by heating at 100 °C for 5 min.
    4. Half of each sample is fractioned by SDS-PAGE and detect phosphatase on the gel by Coomassie blue staining (Simpson, 2010).
    5. The other half of each sample is used to detect the phosphorylation status of c-MYC at Ser62 by Western blotting using anti-pSer62 antibody.
    6. After phosphorylation detection, strip the membrane using 0.8 N NaOH for 30 sec. Detect total c-Myc protein substrate with anti-c-Myc antibody.

Data analysis

HA-c-Myc purified from HEK293T cells was incubated with purified GST, GST-SCP1-WT, and GST-SCP1-DN proteins at 37 °C for 30 min. The immunoprecipitates are analyzed using anti-pSer62, anti-c-Myc, or anti-GST antibodies. SCP1 dephosphorylates c-Myc at Ser62 in vitro, analyzed using Western blotting.


Figure 1. SCP1 dephosphorylates c-Myc at Ser62 in vitro (Wang et al., 2016)

Recipes

  1. Phosphate-buffered saline (PBS)
    137 mM NaCl
    2.7 mM KCl
    10 mM Na2HPO4
    1.8 mM KH2PO4
    Adjust the pH to 7.4
  2. IP lysis buffer
    50 mM Tris-HCl, pH 7.5
    150 mM NaCl
    0.5 mM EDTA
    0.5% Triton X-100
    Add 1 mM PMSF, Roche cOmplete protease inhibitor cocktail and phosSTOP tablet before use
    Adjust NaCl concentration or/and Triton X-100 level to obtain optimum condition for different phosphatases and different antibodies
  3. Phosphatase reaction buffer
    50 mM Tris-HCl, pH 6.8
    150 mM NaCl
    1 mM EDTA, pH 8.0
    10 mM DTT without phosphatase inhibitors
  4. 5x SDS loading buffer
    5% β-mercaptoethanol
    0.02% bromophenol blue
    30% glycerol
    10% sodium dodecyl sulfate (SDS)
    250 mM Tris-Cl, pH 6.8
  5. GST elution buffer
    3.4 mM reduced dry glutathione
    50 mM Tris-HCl pH 8.0

Acknowledgments

This work was supported by grants from National Natural Science Foundation of China (31501141).

References

  1. Lin, Y. C., Lu, L. T., Chen, H. Y., Duan, X., Lin, X., Feng, X. H., Tang, M. J. and Chen, R. H. (2014). SCP phosphatases suppress renal cell carcinoma by stabilizing PML and inhibiting mTOR/HIF signaling. Cancer Res 74(23): 6935-6946.
  2. Simpson, R. J. (2010). Rapid Coomassie blue staining of protein gels. Cold Spring Harb Protoc 2010(4): pdb prot5413.
  3. Wang, W., Liao, P., Shen, M., Chen, T., Chen, Y., Li, Y., Lin, X., Ge, X. and Wang, P. (2016). SCP1 regulates c-Myc stability and functions through dephosphorylating c-Myc Ser62. Oncogene 35(4): 491-500.
  4. Wrighton, K. H., Willis, D., Long, J., Liu, F., Lin, X. and Feng, X. H. (2006). Small C-terminal domain phosphatases dephosphorylate the regulatory linker regions of Smad2 and Smad3 to enhance transforming growth factor-beta signaling. J Biol Chem 281(50): 38365-38375.
  5. Wu, Y., Evers, B. M. and Zhou, B. P. (2009). Small C-terminal domain phosphatase enhances snail activity through dephosphorylation. J Biol Chem 284(1): 640-648.
  6. Yeo, M., Lin, P. S., Dahmus, M. E. and Gill, G. N. (2003). A novel RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase that preferentially dephosphorylates serine 5. J Biol Chem 278(28): 26078-26085.

简介

该方案描述了人蛋白质c-Myc的体外去磷酸化测定的实验程序。 该方案可适用于检测其他Ser / Thr磷酸酶的磷酸酶活性。
【背景】羧基末端结构域RNA聚合酶II多肽小型磷酸酶1(SCP1,也称为CTDSP1或NLI-IF)属于FCP / SCP磷酸酶家族,最初被报道使RNA聚合酶II的C-末端结构域(CTD)脱磷酸化 (Yeo等,2003)。 Smad2,3(Wrighton等,2006),Snail(Wu等,2009),PML(Lin等,2014)和c-Myc(Wang等,2016)也被鉴定为底物 的SCP1。

关键字:去磷酸化, c-Myc, SCP1

材料和试剂

  1. 一次性杯,100ml,PP(聚丙烯)(SARSTEDT,目录号:75.562.105)
    注意:它用于储存细胞沉淀。
  2. 70毫升聚碳酸酯超速离心管
  3. C43(DE3)(Lucigen,目录号:60446)
  4. PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶(Agilent Technologies,目录号:600670)
  5. LB肉汤粉(Sigma-Aldrich,目录号:L3022)
  6. 卡那霉素(Sigma-Aldrich,目录号:K1377)
  7. 聚丙二醇P2000(Sigma-Aldrich,目录号:81380)
  8. Gistex ® LS Ferm - 酵母提取物(Fermia AB,Sweden)
  9. 甘油(VWR,目录号:24388.295)
  10. 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Biosynth,目录号:I-8000)
  11. 十二烷基硫酸钠(SDS)(Sigma-Aldrich,目录号:L4509)
  12. β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,目录号:M3148)
  13. 溴苯酚蓝(Thermo Fisher Scientific,Fisher科学,目录号:BP115-25)
  14. Penta·他的HRP共轭试剂盒(QIAGEN,目录号:34460)
    注意:这是针对His标签的抗体,我们将其用于6x His标记的MgtA的Western印迹分析。该抗体与辣根过氧化物酶(HRP)结合,因此不需要使用二抗。
  15. HEPES(Sigma-Aldrich,目录号:H3375)
  16. 硫酸钾(K 2 O 3 SO 4)(Sigma-Aldrich,目录号:P9458)
  17. 脱氧核糖核酸酶I(Sigma-Aldrich,目录号:DN25)
  18. 苯基甲基磺酰氟(Sigma-Aldrich,目录号:P7626)
  19. 十二烷基-β-D麦芽糖苷(化学点,目录号:CP69227-93-6-BULK)
  20. 咪唑(Sigma-Aldrich,目录号:56750)
  21. 二硫苏糖醇(Biosynth,目录号:D-8200)
  22. 氢氧化钾(KOH)(Sigma-Aldrich,目录号:221473)
  23. Trizma ®基础(生物技术性能认证)(Sigma-Aldrich,目录号:T6066)
  24. PageRuler TM 预饱和蛋白梯(Thermo Fisher Scientific,Thermo Scientific TM ,目录号:26616)
  25. LB肉汤(见食谱)
  26. LB卡那霉素板(参见食谱)
  27. 成长媒介(见食谱)
  28. 1x SDS-PAGE加载缓冲液(参见食谱)
  29. 缓冲液A(参见食谱)
  30. 缓冲液B(参见食谱)
  31. 缓冲区C(见配方)
  32. 缓冲区D(见配方)
  33. 缓冲液E(参见食谱)

设备

  1. 孵化器
  2. 带底的锥形瓶(500毫升)(Saveen& Werner,目录号:00125-54)
    注意:这些烧瓶有四个挡板(导流脊)。它打破介质的循环流动并增加其气体交换表面,从而与正常的锥形瓶相比增加了培养基的氧合。
  3. 带螺帽的瓶子,用于发酵(Saveen& Werner,目录号:88-2L)
  4. LEX(大规模表达)48生物反应器系统(Epiphyte Three,Harbinger Biotechnology and engineering,model:LEX-48 Bioreactor)
  5. 高压匀浆器(用于裂解细胞)(Avestin,型号:EmulsiFlex C3)
  6. Potter-Elvehjem型组织匀浆器(30ml)(WHEATON,目录号:358049)
  7. 70毫升聚碳酸酯超速离心管总成(Beckman Coulter,目录号:355622)
  8. 45 Ti转子(Beckman Coulter,目录号:339160)
  9. Optima TM XE(Beckman Coulter,目录号:A99833)
  10. 色谱柱HP Histrap,5 ml(GE Healthcare,目录号:17-5248-02)
  11. HiLoad 16/600 Superdex 200 pg色谱柱(GE Healthcare,目录号:28-9893-35)
  12. Vivaspin 20 MWCO 50,00 PES(Saveen& Werner,目录号:VS2032)

软件

  1. Image Lab TM 软件
  2. UNICORN软件与ÄKTA净化器相关

程序

  1. 过度表达MgtA
    从E扩增 mgtA 基因。使用PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶与前述的引物(Subramani等人,2016),使用大肠杆菌DH5α基因组DNA。按照PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶手册的建议进行反应混合物和PCR条件。将扩增的基因插入pETM11载体(EMBL)中的NcoI和XhoI 限制性位点之间。因此,表达的MgtA将包括6x His标签,随后是N-末端的烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶位点。
    1. 将pETM11(mgtA )质粒转化到C43(DE3)感受态细胞中,并在LB卡那霉素平板上平板,并在37℃下孵育16小时。
    2. 随机选择5个菌落,并接种在含有200μg含有50μg/ ml卡那霉素的LB培养基的500ml带挡板底锥形瓶中。将烧瓶在37℃下以150rpm培养16小时
    3. 对于C43(DE3)细胞中MgtA的大规模过表达,我们使用LEX 48生物反应器系统(Harbinger Technology LEX TM )。
      注意:LEX系统通过穿过螺旋盖的喷雾器提供过滤的压缩空气。它提供了螺旋盖瓶中的细菌培养物的通气和混合。将培养瓶置于温度控制的水浴中,LEX 48可容纳24×2L标准螺帽。通常只有75%的瓶容量用于避免曝气过程中的介质溢出。
    4. 将1%的过夜培养物接种到含有1.5L生长培养基,50μg/ ml卡那霉素和1.5ml聚丙二醇(PPG)P2000(消泡剂)的2L螺帽中。
    5. 将瓶子放在Lex 48生物反应器水浴中。将水浴的温度设置在37°C,并启动通过分布器的气流。
    6. 每小时测量600nm(OD 600)的光密度。消泡剂PPG P2000在这些条件下变得浑浊,并且可以在冰中孵育5分钟后清除。因此,在OD 600测量之前,从2L瓶中取出1ml培养物,并在冰上孵育5分钟。
    7. 当OD 600小于0.6-2时,停止气流,并通过加冰将水浴冷却至17℃。将培养瓶放在17°C 30分钟以确保细菌培养物的等温。为了通过蛋白质印迹检查水平的过度表达(参见步骤12),将1ml细胞培养物沉淀在12,000xg,4℃,并标记为S (未诱导)。
    8. 向每个瓶中加入1mM IPTG和另外1.5ml PPG P2000。开始气流,并将气瓶在17°C下放置16小时并连续流动。
    9. 要终止诱导,将培养瓶转移到冰上。从12000xg,4℃的每个瓶中取出1ml细菌培养物,并标记为SⅠ(诱导)用于Western印迹分析。
    10. 在4℃将细胞培养物以7,000xg离心20分钟,将得到的细胞沉淀物分成50g等分试样置于100ml一次性杯中,并储存在-20℃直到进一步使用。 br />
    11. 在1×SDS-PAGE加载缓冲液中悬浮S UI 和S 样品小瓶以将OD 600标准化至10并在室温下孵育5分钟。在4℃下以20,000×g离心裂解的细胞20分钟。对于蛋白质印迹分析,使用10μl上清液,并对Penta·His HRP缀合的抗体进行印迹,以检测MgtA过表达。
      注意:通过蛋白质印迹确认MgtA过表达在他开始使用蛋白质纯化过程之前,高度推荐他的HRP抗体,因为在纯化过程中使用的洗涤剂是昂贵的,并且在此阶段可以确定与过表达相关的任何问题。不要煮沸用于SDS-PAGE和Western印迹分析的样品。

  2. 细胞溶解和增溶
    1. 将冰冻的细胞沉淀物在冰上解冻,并以1:10(wt / vol)比例悬浮在缓冲液A中
    2. 使用EmulsiFlex-C3(高压均质器(HPH))通过在11,000psi下通过细胞悬浮液三次来裂解细胞。除非另有说明,否则始终将样品存放在冰上。
      注意:我们没有测试其他裂解方法,如超声处理和搅拌器。但我们相信,也可以使用它们。预期蛋白质产量将根据裂解方法而有所不同。
    3. 在4℃下将细胞裂解物以20,000 x g离心20分钟以除去未分解的细胞和包涵体。
    4. 收集上清液,并在4℃下以100,000×g离心2小时以使内膜和外膜(混合膜)沉淀。
      注意:该步骤需要超速离心机,根据样品的体积选择转子和管。例如,如果样品尺寸为70ml,则可以使用45Ti转子和70ml聚碳酸酯超速离心管,其中可以使用超离心机OptimaXE。重要的是将用于超速离心的管子填充到管的颈部,在管的液体和帽之间可能没有间隙,以避免在离心过程中管内爆。
    5. 使用Potter-Elvehjem型组织匀浆器将所得的混合膜沉淀物悬浮在缓冲液B中,10次。使用1:10(wt / vol)混合膜缓冲B比。在将所需量的缓冲液B加入到膜片中之前,取出10 ml溶解洗涤剂 注意:膜悬浮液可以用液氮快速冷冻,如果不立即使用,储存在-80℃。
    6. 我们使用1%β-十二烷基麦芽糖苷(β-DDM)来溶解膜蛋白。称取所需量的洗涤剂粉末并溶解在预留的10ml缓冲液B中
    7. 将溶解的β-DDM滴加到混合膜悬浮液中,同时以4℃的转速150rpm搅拌。悬浮液在4℃下再搅拌60分钟。

  3. MgtA的净化
    1. 在使用前,用5柱体积(CV)的脱气MQ水洗涤Histrap HP 5 ml柱,并用10 CV缓冲液C平衡。
    2. 向步骤B7中制备的样品中加入20 mM咪唑(pH 7.6),并以2 ml / min的速度装载到Histrap柱上。
    3. 加载溶解的膜样品后,用10 CV缓冲液C和3 CV的15%缓冲液D以3ml / min洗涤Histrap柱。我们观察到一个小峰(图1A,峰1),同时用15%缓冲液D洗涤
    4. 通过以3ml / min通过50%缓冲液D从Histrap柱洗脱MgtA。我们观察到一个相对较大的峰(图1A,峰2),同时用缓冲液D洗涤
    5. 从每个级分取5μl样品,并用12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳
    6. 我们观察到,峰1含有一小部分MgtA以及其他杂质,而峰2含有> 80%纯MgtA,通过SDS-PAGE评估(图1A)
    7. 将相应于峰2的级分收集,并使用vivaspin 20(具有50kDa截止值的蛋白质浓缩器)浓缩至6mg / ml。
    8. 在浓缩级分时,通过用1.5 CV的脱气MQ和1.5 CV缓冲液E以0.5ml / min洗涤,制备连接到ÄKTA净化器的HiLoad 16/600 Superdex 200pg柱。
    9. 在HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱上以0.5 ml / min的速度加入1 ml浓缩的MgtA(6 mg / ml),并通过1.5 CV缓冲液E.
    10. 我们观察到空隙体积(44ml)处的小峰,然后在〜55ml处存在主要单分散峰(图1B,峰S1)。
    11. 对于SDS-PAGE分析,加载5μl对应于12%聚丙烯酰胺凝胶上观察到的峰的级分。我们观察到空隙峰主要含有杂质,而峰S1包含MgtA>通过SDS-PAGE分析纯度为95%(图1B)
    12. 使用vivaspin 20从峰S1中收集级分并浓缩至3 mg / ml
    13. 将浓缩的MgtA分为50μl等分试样,并用液氮快速冷冻并储存在-80℃。
    14. 根据我们的经验,蛋白质在这些条件下稳定超过1年。
       

      图1. MgtA纯化谱的代表性数据。 A. Histrap FF亲和柱的色谱图(左)。使用SDS-PAGE分析来自峰1(泳道1-4)和峰2(泳道6-11)的级分,考马斯染色凝胶(右)显示各峰的纯度。 B.尺寸排阻色谱的色谱图(左图)。使用SDS-PAGE分析来自空隙(泳道1-5)和峰S1(泳道7-14)的级分,考马斯染色凝胶(右)显示各峰的纯度。在两个SDS-PAGE凝胶图片中,MgtA在100kDa条件下运行。

数据分析

图1中色谱图的数据来自与ÄKTA净化器相关的UNICORN软件,并使用GraphPad Prism6绘图。使用Bio-Rad ChemiDoc XRS +系统扫描所有SDS-PAGE凝胶,并使用Image Lab TM 软件进行分析。

食谱

  1. LB肉汤
    在1升MQ和高压釜中混合40克LB肉汤粉末
  2. LB卡那霉素板
    混合40g LB肉汤粉末和7.5g LB琼脂和高压釜
    用50μg/ ml卡那霉素制备LB板
  3. 成长媒体
    40克来自Sigma-Aldrich的LB肉汤粉末(参见材料和试剂)
    10克Fistex LS Ferm酵母提取物
    加入1升MQ和高压釜。接种前,加入10ml 1M Tris-Hcl pH 7.4和5ml甘油
  4. 1x SDS-PAGE加载缓冲液
    2%SDS
    10%甘油
    5%β-巯基乙醇
    0.002%溴酚蓝
    63mM Tris-HCl,pH6.8
  5. 缓冲区A
    50mM HEPES,pH 7.0(KOH)
    100mM K 2 SO 4
    10%甘油
    1 mM PMSF
    5mMβ-巯基乙醇
    1μg/ ml DNase
  6. 缓冲区B
    25mM HEPES,pH 7.0(KOH)
    100mM K 2 SO 4
    5%甘油
    1 mM PMSF
    5mMβ-巯基乙醇
  7. 缓冲区C
    25mM HEPE,pH 7.0(KOH)
    100mM K 2 SO 4
    5%甘油
    1 mM PMSF
    5mMβ-巯基乙醇
    20mM咪唑,pH7.6。
    3 CMCβ-DDM
  8. 缓冲区D
    25mM HEPES,pH 7.0(KOH)
    100mM K 2 SO 4
    5%甘油
    1 mM PMSF
    5mMβ-巯基乙醇
    300 mM咪唑pH 7.6
    3 CMCβ-DDM
  9. 缓冲区E
    25mM HEPES,pH 7.0(KOH)
    100mM K 2 SO 4
    5%甘油
    1mM二硫苏糖醇 3 CMCβ-DDM

注意:用于色谱的缓冲液总是使用连接到真空泵的Nalgene TM 可重复使用的瓶顶过滤器进行过滤。缓冲液用相同的装置脱气,但是通过在真空继续打开并且持续搅拌的同时关闭过滤室。将缓冲液脱气至溶液中未观察到气泡

致谢

挪威研究理事会资助(F-RIMEDBIO)#ES486454和NCMM核心资金支持这项研究。

参考

  1. Faraco,M.,Spelled,C.,Bliek,M.,Verweij,W.,Hoshino,A.,Espen,L.,Prinsi,B.,Jaarsma,R.,Tarhan,E.,de Boer,AH, Di Sansebastiano,GP,Koes,R.和Quattrocchio,FM(2014)。  通过两种不同P-ATP酶在叶绿体中的联合作用,液泡的过度酸化决定了花的颜色。6(1):32-43。 >
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Copyright: © 2017 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Liao, P., Wang, W. and Ge, X. (2017). In vitro Dephosphorylation Assay of c-Myc. Bio-protocol 7(2): e2011. DOI: 10.21769/BioProtoc.2011.
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