材料和试剂

相似年龄的大豆转基因和非转基因植物
感染了豆薯层锈菌（Phakopsora pachyrhiziz）的叶子（图1A）
Tween 20（Labsynth）
Uredospore悬浮液（参见配方）

图1.大豆对背叶表面锈病感染的反应 A. Tan，B.红棕色和（C）免疫。

设备

培养皿（Ø9厘米）
手动喷雾器，可以调整喷涂1毫升体积（图2A和2B，视频1）
植物培养室
生长室
立体显微镜
层流无菌室
Neubauer房间

图2.手动喷雾器

视频1.手动喷雾器调整为喷涂1 ml容积

程序

在田间随机取样感染了豆薯层锈菌的叶子。或者，将确定的分离株的孢子在温室条件下在植物上繁殖。取样后立即将叶子在室温下储存在干燥的塑料或纸袋中至多4天。然而，预期最近在冷藏下收集或存储的材料的结果更好在实验室中，使用油漆刷将旋孢子从叶子中分离到合适的干燥管中，如视频2所示。该步骤应在接种之前短时间进行，这意味着，进行3- 5个步骤。子孢子的量取决于将包括在实验中的叶子的量。要获得估算，请参阅步骤3和步骤6.

视频2. Uredospores使用画笔刷出树叶
使用无菌蒸馏水，1滴Tween 20和冰孢子制备50ml冰孢子悬浮液至终浓度为1×10 5孢子/ml。使用Neubauer室估计冰孢子的浓度。使用移液管加入吐温20，如视频3所示.50ml溶液可用于感染大约50片叶子。

视频3.使用1 ml移液器一滴Tween 20
将大豆转基因和非转基因植物在26±1℃的植物培养室中以22.5μE/m 2/s的光强度以16/8小时光/暗循环进行培养。从相同年龄的植物收集具有相似大小和位置的完全扩展的三叶叶。优选使用2个月大的植物的最新完全扩展的叶（V5或V6阶段），但也可以使用其它生长阶段的植物。
从该步骤向前，材料在层流柜中无菌操作。将叶子在无菌蒸馏水中漂洗（快速浸没）并在无菌滤纸上快速干燥。将每个小叶切成5cm×5cm的片，并将其背侧向上单独放置在含有用蒸馏水饱和的滤纸的无菌培养皿（Ø9cm）中以保持高湿度（图3）。

图3.在含有饱和水的滤纸的培养皿中，大豆叶片的背面向上。
通过喷洒1ml冰孢子悬浮液（10μL孢子/ml）接种每片叶片。在每次接种之前立即混合冰孢子悬浮液。手持喷雾器和叶片之间保持10cm的距离。
将培养皿在20℃的生长室中以12/12小时光/暗循环温育12天。
在孵育期间每2天目测评价材料的损伤和脓疱的存在。
在温育12天后，消除显示其它疾病或腐烂的信号的叶子（图4）。根据存在于叶的背侧的损伤类型（免疫，红棕色或棕褐色）将剩余材料视觉分类（图1）。另外，在立体显微镜下记录每片叶片上的损伤数，具有脓疱的损伤数，每个损伤的脓疱数，脓疱总数和开放的脓疱总数，（见注4;图5 ）。最后，在每个叶片中测定两个1cm×1cm的感染区域并切下。将每1cm 2片放置在含有500μl水的微量管中并剧烈涡旋1分钟。使用Neubauer室在立体显微镜下估计每cm 2的平均孢子数。

图4.显示其他疾病或腐烂信号的叶片示例

图5.用于比较基因型对铁锈感染的反应的参数。 A.无脓疱的病变; B.具有一个脓管的病变（由箭头指示）; C.具有多个脓疱的病变（由箭头指示）; D.锥形开放性脓疱（左）和锥状未开放性脓疱（右）; E.锥形开放的脓疱，在顶部具有孔，在内部（左）具有孢子，在锥体顶部具有孢子的开放脓疱（右）。
从每个叶片获得的结果被认为是重复的。使用来自相同植物的树叶片段和来自每个转基因事件的至少两个植物。
使用相同遗传背景的未转化植物作为对照。理想地，易感和部分抗性品种应当用作实验条件的阳性和阴性对照

笔记

只要有可能，材料应进行无菌操作，以避免交叉污染
Twizeyimana等人（2007）将叶放在培养基上。由于交叉污染和腐烂，我们不能使用相同的培养基建立协议
使用完整的叶子将有助于防止交叉污染和腐烂。然而，更大的培养皿和更多的生长室中的空间将是进行实验所必需的
锈病症状开始于叶轴表面上的小病变，其尺寸逐渐增大，并且从灰色变为褐色或红棕色。大豆锈病产生两种类型的损伤：褐色（图1A）和红棕色（图1B）。当成熟时，棕褐色损伤由被稍微变色的坏死区域和大量褐色孢子包围的小脓疱组成（图5B-E）。红棕色病变具有较大的红棕色坏死区，具有有限数目的脓疱和很少可见的孢子。成熟的大豆锈病脓疱是圆锥形的，在顶部具有孔，在圆锥体内部或圆锥上具有孢子（图5D-E）。（ http://www.aphis.usda.gov/publications/plant_health/content/printable_version/Soybean_Rust_22.pdf ）。

食谱

悬浮孢子悬浮液
豆腐孢子，1滴吐温20（视频2）和无菌蒸馏水至终浓度为1×10 5孢子/ml。

致谢

我们感谢Emerson M. Del Ponte博士，Juliano dos Santos博士和Larissa Bittecourt的技术援助。这项工作得到了来自国家科学技术委员会（CNPq），协调高级人员协会（CAPES），基础设施建设委员会（FAPERGS）的资助。本方案改编自Scherb和Mehl（2006）和Twizeyimana等人（2007）。

参考文献

Bencke-Malato，M.，Cabreira，C.，Wiebke-Strohm，B.，Bucker-Neto，L.，Mancini，E.，Osorio，MB，Homrich，MS，Turchetto-Zolet，A.，De Carvalho，M 。，Stolf，R.，Weber，R.，Westergaard，G.，Castagnaro，AP，Abdelnoor，RV，Marcelino-Guimaraes，FC，Margis-Pinheiro，M.and Bodanese-Zanettini，大豆WRKY家族的全基因组注释和参与响应的基因的功能表征 Phakopsora pachyrhiziz 感染。 BMC Plant Biol 14（1）：236。
Scherb，C.T。和Mehl，A。（2006）。 SBI杀真菌剂，也适用于其他杀真菌剂类 - 离体叶试验。 FRAC （杀菌剂抗性行动委员会）
Twizeyimana，M.，Ojiambo，P.，Ikotun，T.，Paul，C.，Hartman，G.and Bandyopadhyay，R。（2007）。大豆种质田间，温室和独立叶评估的比较 Plant Dis 91（9）：1161-1169。
Wiebke-Strohm，B.，Pasquali，G.，Margis-Pinheiro，M.，Bencke，M.，Bucker-Neto，L.，Becker-Ritt，AB，Martinelli，AH，Rechenmacher，C.，Polacco， Stolf，R.，Marcelino，FC，Abdelnoor，RV，Homrich，MS，Del Ponte，EM，Carlini，CR，De Carvalho，MC和Bodanese-Zanettini，MH（2012）。无处不在的尿素酶影响大豆对真菌的易感性。植物分子生物学> 79（1-2）：75-87。