材料和试剂

液体培养的胸膜肺炎
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP362）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Thermo Fisher Scientific，Acros Organics，目录号：204855000）
戊二醛（25％，EM级）（Agar Scientific，目录号：R1020）
低胶凝温度琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9414）
高锰酸钾（KMnO 4）（VWR International，BDH，目录号：296444N）
100％乙醇
环氧丙烷（Agar Scientific，目录号：R1080）
Araldite CY212（Agar Scientific，目录号：R1042）
甲基纳迪克酸酐（MNA）（Agar Scientific，目录号：R1083）
十二碳烯基琥珀酸酐（DDSA）（Agar Scientific，目录号：R1052）
苄基二甲胺（BDMA）（Agar Scientific，目录号：R1061）
四硼酸钠（硼砂）（Sigma-Aldrich，目录号：221732）
甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich，目录号：89640）
乙酸铀[UO 2（CH 3 COO）2] 2 H 2 O]（SPI Supplies，目录号：02624-AB）
硝酸铅（II）[Pb（NO 3）2]（Sigma-Aldrich，目录号：228621）
柠檬酸三钠（TAAB，目录号：S011）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
0.125 MSørensen的磷酸盐缓冲液（PB）（参见配方）
4％（v/v）戊二醛在PB中（参见配方）
2％（w/v）低胶凝温度琼脂糖（参见Recipes）
2％（w/v）高锰酸钾（参见配方）
Araldite（参见食谱）
1％（w/v）甲苯胺蓝（参见配方）
醋酸铀（见配方）
雷诺铅柠檬酸盐染色（参见配方）

设备

离心机
铜网（300目）（Agar Scientific，目录号：G2740C）
牙科蜡
一次性塑料巴斯德移液器
一次性聚乙烯烧杯
Eppendorf管（1.5ml）
玻璃或金刚石刀
Hotplate
光学显微镜
烤箱（60°C）
剃刀刀片
旋转器
橡胶嵌入模具
可密封的玻璃小瓶（7ml）
振动器
小铲
灭菌过滤器（孔径：0.22μm）
注射器
TEM（JOEL，型号：JEM-1230）
镊子
超微切片机（Reichert Ultracut E）
Vortexer
SPI Slide-A-Grid ^TM存储盒（SPI Slide-A-Grid ^TM，目录号：02450-AB）

程序

注意：本协议中使用的一些化学物质毒性很大，只能在通风橱下使用足够的预防措施。请在使用前检查MSDS。
超薄切片透射电子显微镜的样品制备需要多天。不同制备阶段的时间表如表1所示
表1.透射电子显微镜样品制备时间表
第1-7天      M.的生长。 laminosus （A）
第8天          固定和预嵌入（B）;最多可存储3个月
第9-11天   脱水和包埋在Araldite（C）;无限期存储
第12天       切片和后染色（D）;最多可存储1年
第13天       在透射电子显微镜下可视化

M.的生长。 laminosus
M。通过用无菌空气鼓泡，在充满Castenholz D或ND培养基（缺乏组合氮）的气体洗涤瓶（Castenholz，1988）中生长。将培养物在约20μE/m 2/s的恒定白光下保持在40℃，直到在表面可见致密的细胞垫（图1）。

图1. M的密集单元格。在Castenholz D培养基中生长的
固定和预嵌入
1. 转移一块细胞垫（相当于一卷的大约100μl）使用1ml移液管置于Eppendorf管中
2. 加入1ml PB，在3,000×g离心2分钟，除去上清液
3. 将细胞重悬在500μl的4％（v/v）戊二醛（有毒！）中，并将管在室温下静置2小时。
4. 在3,000×g离心细胞2分钟并除去上清液。洗细胞在1ml PB中3x，每个步骤之间具有10分钟的温育时间以去除固定剂。通过翻转管重悬细胞。
5. 在最终离心步骤后除去上清液。
6. 重悬细胞在大约等体积的2％（w/v）液体琼脂糖（在60℃下放置小瓶，使用前约30分钟以熔化琼脂糖并保持流体直到使用）。将样品在室温下保存它完全聚合。可以在此停止协议步。样品可以存储在冰箱中最多3个月。
7. 用剃刀刀片将细胞沉淀切成约1-2毫米长的小立方体
8. 将立方体转移到玻璃小瓶中，加入2％（w/v）高锰酸钾溶液以完全覆盖立方体
9. 在4℃下轻轻振荡孵育12小时
10. 取出高锰酸钾溶液，并洗几次样品用蒸馏水洗涤10分钟，直到上清液保留明确。
脱水和嵌入Araldite
注意：所有孵育步骤都使用旋转速度为3rpm的旋转器进行。
1. 通过加入30％，50％，70％和90％（v/v）乙醇脱水细胞15分钟和3x 100％（v/v）乙醇洗涤20分钟。每次后除去乙醇孵育步骤
2. 在环氧丙烷中孵育样品5分钟（中毒！），去除上清液，并用丙烯重复洗涤步骤氧化物5分钟以除去剩余的乙醇。除去上清液。
3. 加入新鲜制备的Araldite，直到立方体完全覆盖，孵育1小时
4. 删除Araldite，更换为新鲜的Araldite溶液。孵育过夜。
5. 将样品转移到填充有新鲜的包埋模具中 Araldite溶液，并用镊子清除所有气泡
6. 通过放置Araldite填充嵌入模具聚合样品在60℃下48小时。聚合后样品可无限期储存。
切片和后染色
注意：切片需要很多经验。建议初学者与专家联系。
1. 修剪刀片用剃刀刀片切割，切片厚度为1μm，用超薄切片机
2. 将部分转移到玻璃载玻片上的一滴蒸馏水中使用附在火柴或金属环上的睫毛。干部（约60℃）。
3. 在加热板上用1％（w/v）甲苯胺蓝染色30秒
4. 用蒸馏水短暂排出多余的污渍和冲洗部分
5. 在电热板上干燥，并在光学显微镜中定位细胞
6. 进一步减小块的大小以获得最小可能的块面积包括感兴趣的样品和准备超薄切片约70nm厚度
7. 将部分转移到铜网格。
8. 将饱和的乙酸铀酰水滴（有毒！）滴在a 一块牙科蜡在培养皿和浮动网格（部分向下）在液滴上4分钟（视频1）。
  
  视频1
9. 通过将约10次浸入蒸馏水中来洗涤网格。重复三次。（视频1）
10. 用一块滤纸的边缘刮掉多余的水，和将网格转移到放置在雷诺兹柠檬酸铅上的液滴牙科蜡。着色4分钟（视频1）。
11. 如步骤9所述，用蒸馏水清洗。
12. 在观察之前，喷掉多余的水，并让部分干燥在TEM。网格可以随时用于TEM。长期储存（最多1年）网格保存在网格存储盒（例如 SPI Slide-A-Grid ^TM存储盒）。样品显微照片如图2所示。
  
  图2.通过毛细管的超薄切片的电子显微照片。在Castenholz ND培养基中生长的。在氮剥夺下。 laminosus 区分光合活性营养细胞（veg）转化为固氮杂合体（het），其具有额外的多层包膜（env）作为气体扩散阻挡层以减少O 2入口进入杂合子。当细丝通过坏死的形成破裂时（"释放细胞"），前一细胞的一小部分保持附着到毛状体（cb）。不同的膜用黑色突出显示箭头：类囊体膜（tm），细胞质膜（cm）和外部膜（om）。比例尺，2μm

食谱

0.125MSørensen的磷酸盐缓冲液（PB）（pH 7.2-7.4） 450ml 0.2M磷酸氢二钠（28.4g，在1,000ml蒸馏水中） 150ml 0.2M磷酸二氢钾（27.2g，在1,000ml蒸馏水中） 381ml蒸馏水
储存在4°C
4％（v/v）戊二醛的PB
4ml 25％戊二醛
21 ml PB
储存在4°C
1个月内使用
2％（w/v）低凝胶化温度琼脂糖加入0.2 g琼脂糖至10 ml PB
放在80°C的烤箱中，偶尔搅拌直到琼脂糖完全溶解
储存在4°C
2％（w/v）高锰酸钾将2g高锰酸钾加入10ml蒸馏水中
涡旋和过滤溶解
在使用前新准备
Araldite
40ml Araldite CY212
60ml十二烯基琥珀酸酐 2ml甲基纳迪克酸酐
1ml苄基二甲胺
在一次性聚乙烯烧杯中用刮刀搅拌至少5分钟; 引入尽可能少的空气
在室温下放置1小时
在使用前新准备
1％（w/v）甲苯胺蓝
将1克甲苯胺蓝加入100ml蒸馏水中的1％（w/v）四硼酸钠中通过煮沸和偶尔搅拌溶解
过滤并在室温下贮存
乙酸乙烯酯
将1 g醋酸双氧铀添加到100 ml蒸馏水中
剧烈振荡，在室温下放置48小时使其溶解如果所有的乙酸双氧铀已经溶解，再加入1g并剧烈摇动
在室温下再放置48小时
重复，直到没有更多的醋酸铀溶解，一些未溶解的试剂保持
雷诺铅柠檬酸盐染色
将2.66克硝酸铅溶于30毫升蒸馏水中将3.52g柠檬酸三钠溶于30ml蒸馏水中
合并溶液，并在30分钟内每5分钟强力振荡30秒加入16ml 1M氢氧化钠溶液
混合直到溶液澄清
加入蒸馏水至终体积为100ml 储存在4°C

致谢

这项工作是由伦敦女王玛丽大学的大学学生支持。

参考文献

Castenholz，R.W。（1988）。 [3]蓝藻培养方法方法 167：68-93。
Luft，J.H。（1956）。高锰酸盐; 一种用于电子显微镜的新固定剂。 2（6）：799-802。
Nurnberg，D.J.，Mariscal，V.，Parker，J.，Mastroianni，G.，Flores，E.and Mullineaux，C.W。（2014）。 V部蓝藻菌复合多细胞原核生物中的枝状细胞和细胞间通讯。 Mol Microbiol 91（5）：935-949