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Isolation and Characterisation of Dendritic Cells from Peripheral Blood
外周血液中树突细胞的分离和特性描述

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本文章节

Abstract

Latency and reactivation of human cytomegalovirus (HCMV) is intimately associated with the myeloid lineage. Multiple studies have used in vitro protocols to generate dendritic cells (DCs) from myeloid precursors. Here we describe the direct isolation of DCs from peripheral blood to study HCMV latency directly in this cell type.

Keywords: Dendritic cell(树突状细胞), Cell purification(细胞纯化), Cytomegalovirus(巨细胞病毒)

Materials and Reagents

  1. 100 ml peripheral blood obtained via subcutaneous venepuncture
  2. Heparin - to prevent clotting of blood
  3. Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, catalog number: 10771 ) or any equivalent ficoll solution (density 1.077 g/ml)
  4. Fetal calf serum (FCS)
  5. PBS (chilled)
  6. DC isolation kit (Miltenyi Biotec, catalog number: 130-094-487 )
  7. Antibodies (BD biosciences unless stated otherwise)
    1. Anti-TCRa/b-FITC (catalog number: 347773 ) - isotype with mouse IgG1-FITC
    2. Anti-CD19-FITC (catalog number: 553785 ) - isotype with IgG2a-FITC
    3. Anti-CD14-FITC (catalog number: 561712 ) - isotype with IgG2a-FITC
    4. Anti-HLA-DR-PE (catalog number: 556644 ) - isotype with IgG2a-PE
  8. MACS buffer (see Recipes)

Equipment

  1. Magnetic-activated cell sorting (MACS) magnet
  2. LS columns (Miltenyi Biotec, catalog number: 130-042-401 )
  3. Centrifuge (50 ml tube capacity)
  4. 50 ml polypropylene conical tubes (FalconTM)
  5. 14 ml snap-cap polypropylene tubes

Procedure

  1. Mononuclear cell isolation
    1. Cool MACS magnet adaptor and LS column at 4 °C. LS columns have a total loading capacity of 2 x 109 unpurified cells (which would allow the isolation of 108 labelled cells).
    2. Cool MACS Buffer and PBS on ice.
    3. Dilute the blood 1:1 in PBS.
    4. Add 15 ml histopaque-1077 (density 1.077 g/ml) to a 50 ml conical tube.
    5. Carefully layer 30-35 ml of blood/PBS on top.
    6. Spin at 800 x g for 20 min at RT. No brake on centrifuge.
    7. Take WBC at interphase. To do this use a Pasteur pipette. Squeeze the teat prior to adding to Falcon and then suck up the white fluffy looking layer resting on histopaque. Avoid aspirating excessive histopaque-1077 as it can prevent pelleting of cells.
    8. Pellet cells at 300 x g for 10 min (RT). If there is a problem pelleting cells possibly due to contaminating lymphoprep then dilute a further 1:4 in PBS and repeat centrifugation step.
    9. Wash in cold PBS 300 x g for 10 min. Add 50 ml of PBS to pelleted cells.
    10. Count cells. May need to dilute (1:100). A sample is taken as pre-sort control for FACs analysis to determine enrichment.
    11. Centrifuge at 300 x g for 10 min (RT).
    12. Re-suspend pellet in 300 µl of MACS buffer per 108 total cells. So for 3 x 109 the cells would be re-suspended in 9 ml. Add 100 µl of FcR Blocking reagent (in kit) per 108 and 100 µl of Microbead dendritic antibody cocktail.
    13. Incubate for 10 min at 4 °C.
    14. Transfer to a 50 ml Falcon and wash in PBS. Spin 300 x g for 10 min (RT).
    15. As spin ends, charge the column.
    16. To charge the column insert LS column into magnet. Then run 3 ml of MACS buffer through the column. Discard flow through.
    17. Re-suspend the centrifuged cells in 500 µl of MACS buffer per 108 cells and add to column.
    18. Collect flow through. Re-apply this flow through to the column. Collect again and then wash the column a further two times with 3 ml washes. The flow through represents the dendritic cell population.
    19. Count cells.
    20. Cells are then used for downstream application.

  2. FACS staining
    1. Using the cell count above. 105 cells are pelleted (400 x g for 5 min) in FACs tubes and re-suspended in residual PBS in tube (approximately 50 µl).
    2. Add 1 µl of normal mouse serum to cells and incubate for 10 min (RT).
    3. Proceed directly to adding directly conjugated antibody to cells (or isotype matched controls) as dictated by antibody datasheet. Stain in presence of normal serum. Stain for 20 min at RT in the dark (unless IgM which is then done at + 4 °C). Have one tube unstained for setting the parameters for collection.
    4. Wash cells in 10x PBS and then spin (400 x g; 5 min, RT). Resuspend in 500 µl and proceed to FACs analysis.
    5. Cells are characterized by the expression of a panel of cell surface markers consistent with a DC phenotype. The cells should be HLA-DRhigh whilst TCR, CD14 and CD19 negative. Cells will also express CD1a, CD86 and CD83low.

Representative data

Figure 1. Isolation of PBMC on histopaque 1077


Figure 2. FACs analysis of putative DCs post isolation shown to be HLA-DR positive and CD14, 19 and TCRα/β negative

Recipes

  1. MACS buffer
    PBS supplemented with 0.5% fetal calf serum and 2 mM EDTA

References

  1. Reeves, M. B. and Sinclair, J. H. (2013). Circulating dendritic cells isolated from healthy seropositive donors are sites of human cytomegalovirus reactivation in vivo. J Virol 87(19): 10660-10667.

简介

人巨细胞病毒(HCMV)的延迟和再活化与骨髓谱系密切相关。 多个研究已经使用体外方案从骨髓前体产生树突状细胞(DC)。 在这里我们描述直接从外周血直接研究HCMV潜伏期直接在这种细胞类型中的直接隔离。

关键字:树突状细胞, 细胞纯化, 巨细胞病毒

材料和试剂

  1. 通过皮下静脉穿刺获得的100ml外周血
  2. 肝素 - 防止血液凝结
  3. Histopaque-1077(Sigma-Aldrich,目录号:10771)或任何等效的ficoll溶液(密度为1.077g/ml)
  4. 胎牛血清(FCS)
  5. PBS(冷藏)
  6. DC分离试剂盒(Miltenyi Biotec,目录号:130-094-487)
  7. 抗体(BD生物科学,除非另有说明)
    1. 抗TCRα/b-FITC(目录号:347773) - 与小鼠IgG 1 -FITC的同种型
    2. 抗CD19-FITC(目录号:553785) - 具有IgG 2a-FITC的同种型
    3. 抗CD14-FITC(目录号:561712) - 具有IgG 2a-FITC的同种型
    4. 抗HLA-DR-PE(目录号:556644) - 具有IgG 2a 2a的同种型
  8. MACS缓冲区(参见配方)

设备

  1. 磁激活细胞分选(MACS)磁体
  2. LS柱(Miltenyi Biotec,目录号:130-042-401)
  3. 离心机(50ml管容量)
  4. 50ml聚丙烯锥形管(Falcon )
  5. 14 ml snap-cap聚丙烯管

程序

  1. 单核细胞分离
    1. 冷却MACS磁体适配器和LS柱在4°C。 LS列有一个总数 负载能力为2×10 9个未纯化的细胞(这将允许 分离10 8个标记的细胞)。
    2. 在冰上冷却MACS缓冲液和PBS。
    3. 在PBS中稀释血液1:1。
    4. 向50ml锥形管中加入15ml histopaque-1077(密度1.077g/ml)
    5. 小心地在上面层30-35毫升血/PBS。
    6. 在室温下以800×g离心20分钟。 离心机上无制动。
    7. 以WBC为界面。 要做到这一点使用巴斯德移液器。 挤 奶嘴在添加到猎鹰之前,然后吸起白色蓬松 基于histopaque的看的层数。 避免吸入过多 histopaque-1077,因为它可以防止细胞沉淀
    8. 颗粒 细胞以300×g离心10分钟(RT)。 如果有颗粒细胞的问题 可能是由于污染淋巴细胞凋亡,然后再稀释1:4英寸 PBS和重复离心步骤
    9. 在冷PBS PBS中洗涤3次,每次10分钟。 向沉淀的细胞中加入50ml PBS
    10. 计数单元格。 可能需要稀释(1:100)。 将样品作为FAC分析的预分选控制以确定富集
    11. 在300×g离心10分钟(RT)。
    12. 在300μlMACS缓冲液中每10 8个总细胞重悬浮沉淀。 所以 对于3×10 9个细胞,将细胞重悬浮在9ml中。 加入100微升的FcR 阻断试剂(在试剂盒中)/10 8和100μlMicrobead树突状细胞 抗体混合物
    13. 在4℃孵育10分钟。
    14. 转移至50ml Falcon并在PBS中洗涤。 旋转300 x g 10分钟(RT)
    15. 当旋转结束时,对柱充电。
    16. 将柱插入物LS柱装入磁体。 然后通过柱运行3ml MACS缓冲液。 丢弃流过。
    17. 将离心的细胞重新悬浮于500μlMACS缓冲液中,每10个 8个细胞,并添加到柱中。
    18. 收集流量。 将此流量重新应用到色谱柱。 再次收集,然后再用3 ml洗柱两次 洗涤。 流过物代表树突细胞群。
    19. 计数单元格。
    20. 然后将单元用于下游应用。

  2. FACS染色
    1. 使用上面的单元格计数。 将10 5个细胞沉淀(400×g/5分钟) 在FACs管中并重悬在管中的残余PBS中(约50μL) μl)。
    2. 加入1微升正常小鼠血清的细胞,孵育10分钟(RT)
    3. 直接进行直接添加抗体到细胞(或   同种型匹配的对照)。 污点 存在正常血清。 在室温下在黑暗中染色20分钟(除非IgM   然后在+ 4℃下进行)。 有一个管未设置 参数收集。
    4. 在10x PBS中洗涤细胞,然后旋转(400×g; 5分钟,RT)。 重悬在500微升,并进行FACs分析。
    5. 细胞的特征在于表达一组细胞表面   与DC表型一致的标记。 细胞应该是HLA-DR ,而TCR,CD14和CD19阴性。 细胞还将表达CD1a, CD86和CD83

代表数据

图1.在histopaque 1077上分离PBMC


图2.在分离后显示为HLA-DR阳性且CD14,19和TCRα/β阴性的假定DC的FAC分析

食谱

  1. MACS缓冲区
    补充有0.5%胎牛血清和2mM EDTA的PBS

参考文献

  1. Reeves,M. B. and Sinclair,J. H.(2013)。 从健康血清阳性供体分离的循环树突细胞是人巨细胞病毒再活化的位点, 613> 87(19):10660-10667。
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引用:Reeves, M. and Sinclair, J. (2014). Isolation and Characterisation of Dendritic Cells from Peripheral Blood. Bio-protocol 4(22): e1300. DOI: 10.21769/BioProtoc.1300.
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