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Bone Resorption Assay
骨吸收分析   

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本文章节

Abstract

The Bone resorption assay provides an easy to use protocol for quantitatively measuring in vitro osteoclast-mediated bone resorption. Osteoclasts can be seeded onto the bone slices and formation of resorption pits can be quantified via toluidinblue staining (Scholtysek et al., 2013).

Materials and Reagents

  1. Osteoclasts
  2. Bone slices (IDS PLC, catalog number: DT-1BON1000-96 )
  3. Isopropanol
  4. Toluidine blue O (Sigma-Aldrich, catalog number: 198161 )
  5. MilliQ water
  6. 96 well plates for cell culture (Greiner Bio-One GmbH, catalog numer: 650185 )

Equipment

  1. OsteoMeasure System (http://www.osteometrics.com/product_info.htm)
  2. Ultrasonic water bath

Procedure

  1. Osteoclasts were plated (250,000 cells/well) in the presence and absence of calvarial osteoblasts in 96-well plates, previously equipped with bone slices.
  2. Cells were cultured in appropriate media for at least 14 days at 37 °C.
  3. After this time cells were washed twice with PBS and removed from bone slices via ultrasonication in 250 µl of 70% isopropanol for at least 15 min at high power.
    Note: A volume of 250 µl of 70% isopropanol before ultrasonication makes it easier to get rid of the cells.
  4. Resorption pit formation was visualized by 100 µl toluidine blue (1%; dissolved in water) staining for 2 min at RT.
  5. The slices were then rinsed with 250 µl MilliQ water at least 5 times to wash out residues.
  6. Resorption pits are now stained in dark blue (Figure 1) and resorption area can be quantified via Osteomeasure System or resorption pits/well can be counted via light microscopy.


    Figure 1. Resorption pit formation

Acknowledgments

This protocol was adapted from the previously published paper Scholtysek et al. (2013).

References

  1. Scholtysek, C., Katzenbeisser, J., Fu, H., Uderhardt, S., Ipseiz, N., Stoll, C., Zaiss, M. M., Stock, M., Donhauser, L., Bohm, C., Kleyer, A., Hess, A., Engelke, K., David, J. P., Djouad, F., Tuckermann, J. P., Desvergne, B., Schett, G. and Krönke, G. (2013). PPARbeta/delta governs Wnt signaling and bone turnover. Nat Med 19(5): 608-613.

简介

骨吸收测定法提供了用于定量测量体外破骨细胞介导的骨吸收的易于使用的方案。 破骨细胞可以接种到骨切片上,并且可以通过甲苯胺蓝染色来定量吸收凹陷的形成(Scholtysek等人,2013)。

材料和试剂

  1. 破骨细胞
  2. 骨切片(IDS PLC,目录号:DT-1BON1000-96)
  3. 异丙醇
  4. 甲苯胺蓝O(Sigma-Aldrich,目录号:198161)
  5. MilliQ水
  6. 用于细胞培养的96孔板(Greiner Bio-One GmbH,目录号:650185)

设备

  1. OsteoMeasure系统( http://www.osteometrics.com/product_info.htm
  2. 超声波水浴

程序

  1. 在预先装备有骨切片的96孔板中,在存在和不存在颅盖成骨细胞的情况下将破骨细胞铺板(250,000个细胞/孔)。
  2. 将细胞在合适的培养基中在37℃下培养至少14天。
  3. 此后,用PBS洗涤细胞两次,并通过在250μl的70%异丙醇中在高功率下超声破碎至少15分钟从骨切片中除去。
    注意:在超声​​波处理之前,使用250μl的70%异丙醇,容易清除细胞。
  4. 通过在室温下用100μl甲苯胺蓝(1%;溶于水)染色2分钟使吸收坑形成可视化。
  5. 然后将切片用250μlMilliQ水漂洗至少5次以洗掉残余物。
  6. 吸收凹坑现在被染成深蓝色(图1),吸收区域可以通过骨骼系统或吸收凹陷/孔可以通过光学显微镜计数。

    图 1。 吸收坑形成

致谢

该协议改编自以前发表的文章Scholtysek等人(2013)。

参考文献

  1. Scholtysek,C.,Katzenbeisser,J.,Fu,H.,Uderhardt,S.,Ipseiz,N.,Stoll,C.,Zaiss,MM,Stock,M.,Donhauser,L.,Bohm,C.,Kleyer A.,Hess,A.,Engelke,K.,David,JP,Djouad,F.,Tuckermann,JP,Desvergne,B.,Schett,G.andKrönke,G。(2013)。 PPARbeta/delta支配Wnt信号转导和骨转换。 em> 19(5):608-613。
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Copyright: © 2014 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Scholtysek, C., Krönke, G. and Schett, G. (2014). Bone Resorption Assay. Bio-protocol 4(14): e1187. DOI: 10.21769/BioProtoc.1187.
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