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Isolation of the Secretome from Bacillus subtilis
从枯草杆菌中分离分泌蛋白质组   

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本文章节

Abstract

Bacteria are commonly known to secret proteins in large amounts into the surrounding environment in high concentrations via various pathways. These proteins can be involved in numerous processes like cell-cell communication, exopolymer formation but also metabolic active enzymes are secreted that are interesting for industrial production of proteins. One of the most regularly used organisms for industrial protein production is the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis (B. subtilis). Here we describe a protocol that can be used to quantitatively and qualitatively analyze secreted proteins from B. subtilis.

Materials and Reagents

  1. B. subtilis
  2. Trichloroacetic acid (Merck KGaA, catalog number: 1.00.807.0250 )
  3. Acetone (J.T.Baker®, catalog number: 9006-01 )
  4. BCA-assay (Pierce Antibodies, catalog number: 23225 )
  5. Casein Hydrolysate (Oxoid Limited, catalog number: LP0041 )
  6. (CH)-medium (see Recipes)
  7. Solution G (see Recipes)
  8. Resuspension Buffer (see Recipes)

Equipment

  1. 50 ml flasks with baffles
  2. Acrodisc® syringe filters with a pore size of 0.2 µm (Pall, catalog number: 4652 )
  3. Refrigerated centrifuge (e.g. Eppendorf, model: 5810R )

Procedure

  1. Inoculate B. subtilis to an OD600 of 0.1 in appropriate medium [e.g. CH, lysogeny broth (LB), Spizizen minimal medium (SMM); here we used 10 ml cultures in CH-medium].
  2. Grow cells to respective OD600 (here we used an OD600 of 4; cells growing at 37 °C; 150 rpm in 50 ml flasks with baffles).
  3. Harvest cells by centrifugation (≥ 2,800 x g; 4 °C; 20 min).
    Note: Keep cell pellet as a control for later SDS-PAGE analysis.
  4. Transfer the supernatant into fresh tubes and centrifuge again (2,800 x g; 4 °C; 20 min).
  5. Repeat step 4.
  6. Collect the supernatant and sterile filter it using Acrodisc® syringe filters with a pore size of 0.2 µm.
  7. Add ice cold trichloroacetic acid [90% (w/v) stock] to the solution to a final concentration of 10% (v/v). This will result in precipitation of the proteins in the solution.
  8. Harvest the precipitate by centrifugation (11,000 x g; 4 °C, 5 min). A small white pellet should be visible.
  9. Wash the pellet twice with 2 ml of ice cold acetone (PA grade or higher quality) and centrifugation (11,000 x g; 4 °C, 5 min).
    1. For quantitative analysis dry the pellet for 15 min at 60 °C to remove remaining traces of acetone. Furthermore, the pellet should be resuspended in H2O instead of buffer (step 10).
  10. Resuspend the pellet in resuspension buffer (we used a volume of 50 µl).
    Note: The volume can be scaled up or down with respect to your amount of cells (secreted proteins).
  11. The amount of secreted proteins can be analyzed by BCA-assay or analyzed by SDS-PAGE.
    Note: As a control if the isolation has worked successfully the isolated secreted proteins and the pelleted cells (see step 3) should be resuspended in H
    2O or buffer (5-10x volume of pelleted cells) and analyzed by SDS-PAGE. The band pattern of the isolated proteins and the cells should be different. If the band pattern is similar, your isolated proteins are likely contaminated by cells.

Recipes

  1. CH-medium
    50 ml solution G (see below)
    0.05 ml 0.1 M CaCl2
    0.02 ml 1 M MgSO4.7H2O
    0.1 ml 0.0475 M MnSO4
    0.5 ml 2 mg/ml tryptophan
    Sterilize by filtering using Acrodisc® syringe filters; prepare freshly
  2. Solution G
    25.0 g casein hydrolysate
    9.2 g L-glutamic acid
    3.125 g L-alanine
    3.48 g L-asparagine
    3.4 g KH2PO4
    1.34 g NH4Cl
    0.27 g Na2SO4
    0.24 g NH4NO3
    2.45 mg FeCl3.6H2O
    ddH2O 2.35 L and adjust pH to 7.0 by using 10 N NaOH
    Sterilize by autoclaving; stored at 4 °C
  3. Resuspension Buffer
    5 mM MgCl2
    50 mM Tris-HCl (pH 7.4)

Acknowledgments

This protocol is adapted from Bach and Bramkamp (2013).

References

  1. Bach, J. N. and Bramkamp, M. (2013). Flotillins functionally organize the bacterial membrane. Mol Microbiol 88(6): 1205-1217.

简介

通常已知细菌通过各种途径以高浓度将蛋白质大量地分泌到周围环境中。 这些蛋白质可以参与许多过程,例如细胞 - 细胞通讯,外聚体形成,但是也分泌代谢活性酶,其对于蛋白质的工业生产是有趣的。 用于工业蛋白质生产的最经常使用的生物体之一是革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(<枯草芽孢杆菌)。 在这里我们描述可以用于定量和定性分析从分泌蛋白质的协议。 枯草芽孢杆菌。

材料和试剂

  1. B。 枯草芽孢杆菌
  2. 三氯乙酸(Merck KGaA,目录号:1.00.807.0250)
  3. 丙酮(J.T.Baker ,目录号:9006-01)
  4. BCA测定(Pierce Antibodies,目录号:23225)
  5. 酪蛋白水解物(Oxoid Limited,目录号:LP0041)
  6. (CH) - 介质(参见配方)
  7. 解决方案G(参见配方)
  8. 重悬缓冲液(参见配方)

设备

  1. 50ml带有挡板的烧瓶
  2. Acrodisc 注射器过滤器,孔径为0.2μm(Pall,目录号:4652)
  3. 冷冻离心机(例如:Eppendorf,型号:5810R)

程序

  1. 接种 B。 (LB),Spizizen基本培养基(SMM)中,在适当的培养基[例如CH]中培养至OD 600为0.1。 这里我们在CH-培养基中使用10ml培养物]
  2. 将细胞生长至相应的OD 600(这里我们使用4的OD 600;在37℃下生长的细胞;在具有挡板的50ml烧瓶中150rpm)。< br/>
  3. 通过离心收集细胞(≥2,800×g; 4℃; 20分钟)。
    注意:保持细胞沉淀作为后续SDS-PAGE分析的对照。
  4. 将上清液转移到新管中并再次离心(2,800×g; 4℃; 20分钟)。
  5. 重复步骤4.
  6. 收集上清液并使用孔径为0.2μm的Acrodisc 注射器过滤器对其进行无菌过滤。
  7. 向溶液中加入冰冷的三氯乙酸[90%(w/v)储备液]至终浓度为10%(v/v)。 这将导致蛋白质在溶液中沉淀
  8. 通过离心(11,000×g; 4℃,5分钟)收获沉淀物。 一个小的白色颗粒应该是可见的。
  9. 用2ml冰冷的丙酮(PA级或更高质量)和离心(11,000×g; 4℃,5分钟)洗涤沉淀两次。
    1. 对于定量分析,在60℃下干燥沉淀物15分钟以除去残余痕量的丙酮。此外,沉淀应该重悬浮在H 2 O中而不是缓冲液中(步骤10)。
  10. 在重悬缓冲液中重悬沉淀(我们使用50μl的体积) 注意:体积可以相对于您的细胞量(分泌的蛋白质)按比例放大或缩小。
  11. 分泌的蛋白质的量可以通过BCA测定法分析或通过SDS-PAGE分析。
    注意:作为对照,如果分离成功,分离的分泌蛋白和沉淀的细胞(见步骤3)应重新悬浮在H 2 O或缓冲液(5-10倍体积的沉淀细胞)并通过SDS-PAGE分析。分离的蛋白质和细胞的条带模式应当不同。如果条带模式是相似的,你的孤立的蛋白质可能被细胞污染。

食谱

  1. CH-medium
    50ml溶液G(见下文)
    0.05ml 0.1M CaCl 2·h/v 0.02ml 1M MgSO 4。7H 2 O 2 0.1ml 0.0475M MnSO 4
    0.5ml 2mg/ml色氨酸
    注射器过滤器过滤灭菌;使用Acrodisc 新鲜准备
  2. 解决方案G
    25.0g酪蛋白水解产物 9.2g L-谷氨酸 3.125g L-丙氨酸 3.48g L-天冬酰胺 3.4g KH 2 PO 4 sub/
    1.34g NH 4 Cl
    0.27g Na 2 SO 4。
    0.24g NH 4 NO 3 sub。 2.45mg FeCl 3 。 6H 2 O ddH 2 O 2.35L,并用10N NaOH调节pH至7.0 高压灭菌; 储存在4℃下
  3. 重悬缓冲液
    5mM MgCl 2/
    50mM Tris-HCl(pH7.4)

致谢

该协议改编自Bach和Bramkamp(2013)。

参考文献

  1. Bach,J.N.和Bramkamp,M。(2013)。 Flotillins功能性组织细菌膜。 Mol Microbiol 88 (6):1205-1217。

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Copyright: © 2014 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Bach, J. N. and Bramkamp, M. (2014). Isolation of the Secretome from Bacillus subtilis. Bio-protocol 4(2): e1026. DOI: 10.21769/BioProtoc.1026.
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