材料与试剂

1. 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂)
   
2. 焦碳酸二乙酯 (DEPC, Sigma D5758)
   
3. TRIzol (Invitrogen公司)
   
4. 苯酚:氯仿:异戊醇 (体积比25:24:1)或氯仿 (国药试剂，分析纯)
   
5. 异丙醇 (国药试剂，分析纯)
   
6. 无水乙醇或95%乙醇 (国药试剂，分析纯)
   
7. 75%乙醇：用95%乙醇和0.1‰ DEPC处理水配制
   
8. TE缓冲液
   
9. 0.1‰ DEPC处理水 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 研钵和研磨棒
   
2. 移液器：1 ml、200 μl、20 μl、10 μl、2.5 μl (eppendorf)
   
3. 枪头及配套枪头盒：1 ml、200 μl、20 μl (AXYGEN)
   
4. 离心管和配套管架：1.5 ml (AXYGEN)
   
5. 试剂瓶：250 ml
   
6. 50 ml离心管：分装氯仿、异丙醇和酒精
   
7. 4 °C冷冻离心机(eppendorf Centrifuge 5417R)
   
8. 紫外分光光度计：Nanodrop(Thermo Fisher)
   注：器具处理与准备
   1)

   塑料制品：(包括枪头、EP管等)：新枪头和离心管(经伽玛射线灭菌)可直接使用，已开封枪头和离心管经高温高压灭菌后使用。
   
   2)

   玻璃制品：新试剂瓶需酸泡过夜，冲洗干净，0.1‰ DEPC处理水浸泡后盖上锡纸，180 °C，2 h。
   
   
   

实验步骤

1. 组织取样后投入液氮速冻中，可保存于-80 °C。在液氮中将组织研磨成粉，预冷1.5 ml 离心管加入样品0.1 g，并加入1 ml TRIzol (Invitrogen公司)，迅速混匀。
   注：TRIzol中样品可保存于-80 °C冰箱中。
   
2. 室温下静置5-10分钟。向每管1ml TRIzol加入200 μl苯酚:三氯甲烷:异戊醇 (体积比25:24:1)或200µl三氯甲烷，剧烈震荡30秒，室温(25 °C)静置5分钟。
   
3. 4 °C 12,000 rpm离心10分钟，样品分相为三层，其中上层水相为RNA (约为TRIzol的60%)。小心吸取上清500-600 μl转移至新离心管中。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，请勿吸取。
   注：此处可重复步骤2和步骤3以得到更纯的RNA。
   
4. 加入500 μl的异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温(25 °C)静置5-10分钟。
   
5. 4 °C 12,000 rpm离心10分钟，可见白色RNA沉淀于离心管底部，弃上清。
   
6. 每管加入1 ml 75%乙醇，涡旋振荡。
   
7. 4 °C 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。(若将RNA保存于乙醇中，此时可重新加入1 ml预冷的75%乙醇。在75%乙醇中，RNA在4°C至少保存1周，-20 °C至少保存1年。)
   
8. 短暂离心后用20 μl移液器小心吸弃残余75%乙醇。
   
9. 超净台上将RNA沉淀吹至半透明胶状，不能完全干燥(5-10分钟)，根据沉淀多少加30-40 μl灭菌0.1‰ DEPC处理水或TE缓冲液溶解RNA沉淀。
   
10. 55-60°C孵育10分钟。小心混匀样品，并短暂离心。经紫外分光光度计测定浓度后RNA样品可保存于-80 °C冰箱备用。
    
    

RNA质量检测和浓度测定

1. 电泳检测RNA完整性：
   制备甲醛变性，1％琼脂糖凝胶快速电泳，检测RNA分子完整性，观察18S、28S条带是否清晰(图1)。
   
   
   图1. RNA琼脂糖凝胶电泳检测示意图
   
   
2. 紫外分光光度计测定A₂₆₀及A₂₈₀来定量分析RNA的纯度和浓度。用溶解RNA的溶剂读取BLANK，NanoDrop测定RNA浓度。分离RNA的理想效果是A₂₆₀/A₂₈₀=1.8~2.0。

注意事项

1. 试剂配制，器皿处理和操作，严格遵循RNase free原则。
   
2. TRIzol、苯酚、氯仿等有机试剂易燃、易爆且对皮肤和黏膜有刺激性，需在通风橱内进行操作，避免接触皮肤，避免火源。DEPC对眼睛和呼吸道粘膜有刺激，是一种潜在致癌物，操作时应在通风橱内进行。
   
3. RNA沉淀完全干燥，会极大地降低可溶性，部分溶解的RNA其A₂₆₀/A₂₈₀比值 <1.6。
   

可能出现的问题和解决方法(Troubleshooting)：

1. RNA抽提率低或无沉淀：
   1)

   样品未及时处理：样品分离后短时间内细胞内RNA酶被激活，若不及时提取RNA，大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA提取，应立即用液氮冷冻完全，置-80°C贮存。
   
   2)

   系统超负荷：过多样品，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA和蛋白质所占比例增大，使RNA不能有效地释放到上清中，以及降低RNA沉淀效率。
   
   3)

   样品匀浆或裂解不完全：匀浆不完全时，基因组DNA分子为裂解，溶液粘稠。变性的蛋白质和基因组DNA一起形成絮状凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地释放到溶液中。
   
   4)

   沉淀不完全：从小于4 mg植物组织或RNA含量低的植物组织中提取RNA时，匀浆体积过大，造成RNA浓度过低而沉淀失败。从该样品中提取RNA，应按比例减少抽提溶液。
   
   5)

   终RNA溶解不完全：未溶解的RNA丢失。
   
   
2. RNA测定吸光度A₂₆₀/A₂₈₀<1.65：
   1)

   样品匀浆化时所加的TRIzol太少。
   
   2)

   匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。
   
   3)

   分离的水样层有苯酚污染。
   
   4)

   RNA溶解不完全。
   
   5)

   溶解RNA的溶剂pH值不合适。低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。
   
   
3. RNA降解：
   1)

   样品抽提前冻融。
   
   2)

   用于抽提的样品，或抽提的RNA样品保存于-5~ -20°C，而不是存放于-80°C。
   
   3)

   抽提过程中有RNA酶污染
   
   
4. DNA污染
   1)

   样品匀浆化时所加的TRIzol量太少。
   
   2)

   用于抽提的样品中含有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液。
   
   
5. 蛋白多糖和多糖污染：
   下述对RNA沉淀的改进方法能从抽提的RNA中移去复合污染。以匀浆化时每1 ml TRIzol为例，在水样层中加入0.25 ml异丙醇后再加入0.25 ml的高盐溶液(0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl)。将终溶液混匀，离心并继续进行前述的抽提操作。改进后的沉淀法能有效地析出RNA，而多糖和蛋白多糖仍以可溶形式留在溶液中。对于含有大量多糖的植物，在最初匀浆化时多加一次离心并使用改进的沉淀方法可改善抽提效果。
   

溶液配方

1. 0.1‰ DEPC处理水
   将DEPC按照1:10,000(体积比)加入双蒸水，搅拌超过8 h，根据需要可高温高压灭菌。