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[Bio101] Making Yeast Competent Cells and Yeast Cell Transformation
[Bio101] 酵母细胞感受态的制备与转化   

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本文章节

Abstract

This is a quite simple but reliable protocol to make very high transformation efficiency yeast competent cells. By express your gene of interest, protein function can be studied in yeast cells.

Materials and Reagents

  1. Bacto-Yeast extract (Thermo Fisher Scientific)
  2. Bacto-peptone (Thermo Fisher Scientific)
  3. Glucose (dextrose) (Thermo Fisher Scientific)
  4. Bacto-agar (Thermo Fisher Scientific)
  5. Deionized H2O
  6. Glycerol (Sigma-Aldrich)
  7. Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich)
  8. PEG 3350 (Sigma-Aldrich)
  9. Lithium acetate dihydrate (LiAc) (Sigma-Aldrich)
  10. Salmon sperm DNA (Life Technologies, Invitrogen™)
  11. Yeast nitrogen base (YNB) (Sigma-Aldrich)
  12. 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES)
  13. ADE (Sigma-Aldrich)
  14. Agar
  15. YPAD plate & liquid medium (see Recipes)
  16. Transformation solution (see Recipes)
  17. YNB + MA plate (see Recipes)

Equipment

  1. Water bath (VWR International)
  2. Centrifuges (Eppendorf)
  3. 30 °C shaker and incubator (VWR International)
  4. Standard petri dishes (VWR International)
  5. 1.5 ml centrifuge tubes (Eppendorf)

Procedure

  1. Make yeast competent cells (Modified from Gietz & Schiestl, 2007)
    1. Obtain yeast strains of interest and streak on YPAD plates. Let cells grow 2 d before inoculation.
    2. 1st Inoculation: Inoculate one colony into 25 ml YPAD liquid medium. Grow cells overnight at 30 °C with shaking speed around 200 rpm.
    3. 2nd inoculation. Transfer the 25 ml cell culture into 75 ml YPAD medium. Grow cells at 30 °C for 4 h.
    4. Harvest cells by centrifugation at 3,000 x g for 5 min, wash cells with 0.5 volumes of sterile H2O.
    5. Centrifuge again with 3,000 x g for 5 min.
    6. Re-suspend cells in 0.01 volumes of sterile H2O, transfer to a suitable centrifuge tube and pellet at 3,000 x g for 5 min at 20 °C.
    7. Re-suspend cell pellet in 0.01 volumes of filter sterilized frozen competent cell solution (5% v/v glycerol, 10% v/v DMSO).
    8. Dispense 50 µl cells into 1.5 ml Eppendorf tubes.
    9. Place the tubes into a box with Styrofoam or cardboard (slow freezing is essential for good survival rates).
    10. Store the box in a -80 °C freezer (cells can be kept at this condition for up to one year).

  2. Yeast cell transformation
    1. If using competent cells stored at -80 °C, thaw cells at 37 °C water bath for 15-30 sec. if using freshly made competent cells, go to step 2).
    2. Centrifuge at 13,000 x g for 2 min to remove the supernatant.
    3. Make the transformation solution for the planned number of transformations plus one extra (negative control) (see the recipes).
    4. Add the solution to the cell pellet, vortex to re-suspend the cells.
    5. Incubate in a 42 °C water bath for 40 min.
    6. Centrifuge at 13,000 x g for 30 sec and remove the supernatant.
    7. Pipette 1 ml of sterile H2O into the transformation tube to re-suspend the pellet.
    8. Plate 200 µl of the cell suspension onto the YNB + MA plate growth plate with your selection marker.
    9. Incubate plates at 30 °C for 2~4 d.

Recipes

  1. Make YPAD plate & liquid medium
    1% Bacto-yeast extract - 10 g/L
    2% Bacto-peptone -20 g/L
    2% Glucose (Dextrose) - 20 g/L
    If making YPD plates, add 20 g Bacto-agar.
    Fill up to 1 L with deionized H2O.
    NO pH adjustments.
    Note: Autoclave agar and glucose separately, to avoid caramelization.
  2. Transformation solution
    PEG 3350 [50% (w/v)] 260 µl
    1 M LiAc 36 µl
    Salmon sperm DNA (10 mg/ml) 10 µl
    Plasmid 3 µl
    Sterile H2O 51 µl
    Total 360 µl
  3. YNB+ MA plate (100 ml)
    YNB 0.67 g
    20 mM MES 0.39 g
    ADE 0.01 g
    Agar 2 g
    Glucose 2 g

References

  1. Gietz, R. D. and Schiestl, R. H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
  2. Lu, Y., Chanroj, S., Zulkifli, L., Johnson, M. A., Uozumi, N., Cheung, A. and Sze, H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.

简介

这是一个非常简单但可靠的协议,以使非常高的转化效率酵母感受态细胞。 通过表达您感兴趣的基因,可以在酵母细胞中研究蛋白质功能。

材料和试剂

  1. 细菌酵母提取物(Thermo Fisher Scientific)
  2. 细菌蛋白胨(Thermo Fisher Scientific)
  3. 葡萄糖(右旋糖)(Thermo Fisher Scientific)
  4. 细菌琼脂(Thermo Fisher Scientific)
  5. 去离子H 2 O
  6. 甘油(Sigma-Aldrich)
  7. 二甲基亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich)
  8. PEG 3350(Sigma-Aldrich)
  9. 将乙酸锂二水合物(LiAc)(Sigma-Aldrich)
  10. 鲑鱼精DNA(Life Technologies,Invitrogen TM)
  11. 酵母氮碱(YNB)(Sigma-Aldrich)
  12. 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)
  13. ADE(Sigma-Aldrich)
  14. 琼脂
  15. YPAD板& 液体介质(见配方)
  16. 转化解决方案(参见配方)
  17. YNB + MA板(参见配方)

设备

  1. 水浴(VWR国际)
  2. 离心机(Eppendorf)
  3. 30℃振荡器和培养箱(VWR International)
  4. 标准培养皿(VWR International)
  5. 1.5ml离心管(Eppendorf)

程序

  1. 制备酵母感受态细胞(来自Gietz& Schiestl,2007)
    1. 获得感兴趣的酵母菌株并在YPAD平板上划线。 让细胞在接种前2天生长。
    2. 第一次接种:将一个菌落接种到25ml YPAD液体培养基中。 在30℃下以约200rpm的摇动速度生长细胞过夜。
    3. 第二次接种。 将25ml细胞培养物转移到75ml YPAD培养基中。 在30℃下生长细胞4小时。
    4. 通过在3,000×g离心5分钟收获细胞,用0.5体积的无菌H 2 O洗涤细胞。
    5. 再次用3,000×g离心5分钟。
    6. 将细胞重悬在0.01体积的无菌H 2 O中,转移到合适的离心管中,并在3,000×g下在20℃沉淀5分钟。
    7. 在0.01体积的过滤灭菌的冷冻感受态细胞溶液(5%v/v甘油,10%v/v DMSO)中重悬细胞沉淀。
    8. 将50μl细胞分配到1.5 ml Eppendorf管中。
    9. 将管放入一个有泡沫聚苯乙烯或纸板箱(缓慢冷冻是必要的良好的生存率)。
    10. 将盒子存放在-80°C的冰箱中(细胞可以保存在这种条件下长达一年)。

  2. 酵母细胞转化
    1. 如果使用感受态细胞储存在-80℃,解冻细胞在37℃水浴15-30秒。 如果使用新鲜制备的感受态细胞,请转到步骤2)。
    2. 13,000×g离心2分钟以除去上清液。
    3. 为计划的转化数量加上一个额外的(阴性对照)转化解(见配方)。
    4. 将溶液加入到细胞沉淀中,涡旋以重新悬浮细胞。
    5. 在42℃水浴中孵育40分钟。
    6. 在13,000×g离心30秒并除去上清液。
    7. 吸取1毫升无菌H 2 O到转化管中以重新悬浮沉淀。
    8. 板200微升细胞悬液到YNB + MA板生长板上用您的选择标记。
    9. 在30℃孵育平板2〜4天。

食谱

  1. 使YPAD板& 液体介质
    1%细菌 - 酵母提取物 - 10g/L 2%细菌用蛋白胨-20g/L 2%葡萄糖(葡萄糖)-20g/L
    如果制作YPD平板,加入20克细菌琼脂 用去离子H 2 O填充至1L 无pH调整。
    注意:分别高压灭菌琼脂和葡萄糖,以避免焦糖化。
  2. 转换解决方案
    PEG 3350 [50%(w/v)]260μl
    1 M LiAc 36微升
    鲑精DNA(10毫克/毫升)10微升
    质粒3μl
    无菌H 2 O51μl
    共360公升
  3. YNB + MA板(100ml) YNB 0.67克
    20mM MES 0.39g
    ADE 0.01 g
    琼脂2克
    葡萄糖2 g

参考文献

  1. Gietz,R.D。和Schiestl,R.H。(2007)。 可使用LiAc/SS载体DNA/PEG方法高效转化的冷冻感受态酵母细胞 。 Nat Protoc 2(1):1-4。
  2. Lu,Y.,Chanroj,S.,Zulkifli,L.,Johnson,M.A.,Uozumi,N.,Cheung,A.and Sze,H。(2011)。 缺少一对K + 转运蛋白的花粉管未能靶向胚珠 拟南芥。植物细胞 23(1):81-93。
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Lu, Y. (2011). Making Yeast Competent Cells and Yeast Cell Transformation. Bio-protocol Bio101: e96. DOI: 10.21769/BioProtoc.96;
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Casey
Roanoke College
In step 4, does the 0.5 volumes refer to the pellet size, the container to centrifuge, or the whole culture (100mL)?
5/17/2012 2:52:03 AM Reply
How yeast cell is transformed?
3/14/2012 7:23:19 PM Reply
Yongxian Lu
Carnegie Institution for Science, Stanford University, USA

The transformation is heat-shock based: treat cells with 42 degree loosens membrane and so DNA can get in.

3/21/2012 2:35:50 PM