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[Bio101] Arabidopsis Pollen Tube Aniline Blue Staining
[Bio101] 苯胺蓝染色法研究拟南芥花粉管的生长发育

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本文章节

Abstract

The aim of this experiment is to track pollen tube growth in vivo in the female tissues after pollination. This can be used to phenotype pollen germination, tube growth and guidance, and reception.

Materials and Reagents

  1. Stock solutions:
    1. Acetic acid
    2. Ethanol
    3. NaOH
    4. K2HPO4
    5. KH2PO4
    6. Aniline blue (Thermo Fisher Scientific)
    7. Glycerol
  2. Working solutions:
    1. 10% acetic acid in EtOH (fixative)
    2. 0.01% aniline blue in KPO4 buffer (dye)
    3. KPO4 buffer made with 50% glycerol (mounting media)
    4. KPO4 buffer (see Recipes)

Equipment

  1. Microscope with UV light

Procedure

  1. Submerge pistil tissue in 250 µl acetic acid and fix it for 1.5 h or more in an Eppendorf tube. Tissue can be fixed overnight if necessary.
  2. Soften tissue by submerging it in 1 M NaOH overnight.
  3. Wash 3 times with KPO4 buffer (tissue is fragile at this stage).
  4. Stain with 200 µl aniline blue for 5-10 min or as long as 10 h.
  5. Transfer to a slide, add mounting media and observe under UV. Squash if necessary.

Recipes

  1. 50 mM KPO4 buffer (pH 7.5)
    4.17 ml 1 M K2HPO4
    0.83 ml 1 M KH2PO4
    995 ml H2O

References

  1. Lu, Y., Chanroj, S., Zulkifli, L., Johnson, M. A., Uozumi, N., Cheung, A. and Sze, H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.
  2. Modified from the online protocol on Dr. Daphne Preusss’s lab (Univ of Chicago).

简介

小干扰RNA(siRNA)是一类20-25个核苷酸的双链RNA,在许多生物过程中起重要作用(Hamilton和Baulcombe,1999)。 siRNA通过"中和"靶蛋白的mRNA起作用,促进mRNA的降解,从而改变蛋白的生物效应(综述于Hannon和Rossi,2004)。 siRNA也可以改变调节RNA的细胞内水平。 在生物研究中使用siRNA操纵目的基因的表达通常被称为RNA干扰或敲除技术(Elbashir等人,2001)。 合成的siRNA是一种新兴的工具,现在广泛应用于这些研究。 不同公司采用多种算法来设计siRNA产品,其在功效,特异性和成本等方面不同。 在此使用来自Dharmacon的siGENOME SMARTpool试剂解释siRNA敲低的示例方案。......

材料和试剂

  1. 库存解决方案:
    1. 醋酸
    2. 乙醇
    3. NaOH
    4. K 2 HPO 4
    5. KH sub 2 PO 4
    6. 苯胺蓝(Thermo Fisher Scientific)
    7. Glycerol
  2. 工作解决方案:
    1. 10%乙酸的EtOH溶液(固定剂)
    2. 在KPO 4缓冲液(染料)中的0.01%苯胺蓝,
    3. 用50%甘油制备的KPO 4缓冲液(封固介质)
    4. KPO 4 缓冲区(请参阅配方)

设备

  1. 显微镜与紫外光

程序

  1. 浸没雌蕊组织在250微升醋酸中,并将其固定在Eppendorf管中1.5小时或更长时间。 如果需要,组织可以固定过夜。
  2. 通过将其浸没在1M NaOH中过夜来软化组织。
  3. 用KPO 4缓冲液洗涤3次(在该阶段组织是脆弱的)。
  4. 用200μl苯胺蓝染色5-10分钟或长达10小时。
  5. 转移到载玻片,添加安装介质,在紫外线下观察。 必要时加入壁球。

食谱

  1. 50mM KPO 4缓冲液(pH7.5) 4.17ml 1M K 2 HPO 4
    0.83ml 1M KH 2 PO 4>/
    995ml H 2 O·dm /

参考文献

  1. Lu,Y.,Chanroj,S.,Zulkifli,L.,Johnson,M.A.,Uozumi,N.,Cheung,A.and Sze,H。(2011)。 缺少一对K +转运蛋白的花粉管未能在拟南芥中靶向胚珠 。 Plant Cell 23(1):81-93。
  2. 从Daphne Preusss博士实验室(芝加哥大学)的在线协议修改。
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引用:Lu, Y. (2011). Arabidopsis Pollen Tube Aniline Blue Staining. Bio-protocol Bio101: e88. DOI: 10.21769/BioProtoc.88;
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”4.17ml 1M 磷酸氢二钾 + 0.83 ml 1M 磷酸二氢钾 + 995 ml水“这是5mM的吧?
3/26/2015 6:02:52 AM Reply
苯胺蓝染色的原理是什么?与固绿染色原理有什么区别?
3/10/2015 12:17:09 AM Reply

hi , can i use this method for observation of pollen tube growth "in embryo sac" ?

thanks
4/22/2012 12:06:39 AM Reply
Yuanqing Lin
苯胺蓝染色花粉能够显示花粉什么指标:花粉内含物?活力?核?与 Alexander,DAPI,FDA染色花粉等有什么区别
7/11/2011 2:20:50 PM Reply
bio-protocol

Aniline blue stains callose, which is a major chemical component of the pollen tube cell wall. That makes it a good dye to visualize pollen tube growing in vivo.

7/11/2011 2:21:17 PM