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Detection of Released CO2 by Radioactive Lactate
通过放射性乳酸盐检测二氧化碳的释放

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本文章节

Abstract

This method allows to evaluate the degradation of lactate during cellular respiration. During this metabolic process, carbon atoms of lactate can be transformed in carbon dioxide. For this purpose, the radioactive lactate is added to the cells and the amount of radioactive carbon dioxide liberated is monitored. The radioactive carbon dioxide generated during cellular respiration is released into the culture medium and it is further converted into gas through the addition of sulfuric acid to culture media. A piece of Whatman paper wet with phenyl-ethylamine-methanol is placed inside the petri dish to trap radioactive carbon dioxide whose production is then evaluated by scintillator counting.

Materials and Reagents

  1. Petri dish for cell culture (six inches diameter plate)
  2. [U-14C] lactate (U: uniformly labelled) (PerkinElmer, catalog number: NEC599250UC )
  3. 2-Phenethylamine (Sigma-Aldrich, catalog number: P2641 )
  4. Methanol
  5. 4 M H2SO4
  6. Liquid scintillation (PerkinElmer, catalog number: 6NE9529 )
  7. Vials for scintillator (PerkinElmer)
  8. Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
  9. Phenyl-ethylamine-methanol (1:1:1)

Equipment

  1. Incubator for cell culture
  2. Scintillator
  3. Burker chamber
  4. 3 mm Whatman paper

Procedure

  1. Count cells using Burker chamber.
  2. Plate the same number of cells in each plate (30,000 cells).
  3. Wet a disk of Whatman paper with 100 μl of phenyl-ethylamine-methanol (1:1:1).
  4. Put the wetted piece of Whatman paper under the lid of Petri dish.
  5. Add to 1 ml of culture medium 0.2 μCi/ml D-[U-14C] lactate.
  6. Place the cells in incubator at 37 °C, 5% CO2 for 15 min.
  7. Add 200 μl of 4 M H2SO4 to culture medium.
  8. Place 2 ml of scintillation liquid in a vial for scintillation.
  9. Remove the Whatman paper and put it in the scintillation liquid.
  10. Radioactive CO2 released was counted by scintillator.

Acknowledgments

This protocol is adapted from Fiaschi et al. (2012).

References

  1. Fiaschi, T., Marini, A., Giannoni, E., Taddei, M. L., Gandellini, P., De Donatis, A., Lanciotti, M., Serni, S., Cirri, P. and Chiarugi, P. (2012). Reciprocal metabolic reprogramming through lactate shuttle coordinately influences tumor-stroma interplay. Cancer Res 72(19): 5130-5140.

简介

该方法允许在细胞呼吸期间评估乳酸盐的降解。 在这种代谢过程中,乳酸的碳原子可以转化为二氧化碳。 为此,将放射性乳酸盐加入到细胞中,并监测释放的放射性二氧化碳的量。 在细胞呼吸期间产生的放射性二氧化碳释放到培养基中,并通过向培养基中加入硫酸进一步转化为气体。 将一片用苯基 - 乙胺 - 甲醇湿润的Whatman纸置于培养皿内以捕集放射性二氧化碳,然后通过闪烁计数器评价其产量。

材料和试剂

  1. 细胞培养用培养皿(6英寸直径板)
  2. [U- 14 C]乳酸盐(U:均匀标记)(PerkinElmer,目录号:NEC599250UC)
  3. 2-苯乙胺(Sigma-Aldrich,目录号:P2641)
  4. 甲醇
  5. 4 M H <2> SO 4
  6. 液体闪烁(PerkinElmer,目录号:6NE9529)
  7. 闪烁体小瓶(PerkinElmer)
  8. Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)
  9. 苯基 - 乙胺 - 甲醇(1:1:1)洗脱

设备

  1. 细胞培养孵育器
  2. 闪烁器
  3. 打气室
  4. 3毫米Whatman纸

程序

  1. 使用Burker室计数细胞
  2. 在每个板中铺板相同数量的细胞(30,000个细胞)
  3. 用100μl苯基 - 乙胺 - 甲醇(1:1:1)润湿Whatman纸的圆盘。
  4. 将润湿的Whatman纸片放在培养皿的盖子下。
  5. 加到1ml培养基中0.2μCi/ml D-乳酸[U- 14 C]乳酸盐。
  6. 将细胞置于37℃,5%CO 2的培养箱中15分钟
  7. 向培养基中加入200μl4M H 2 SO 4子培养基。
  8. 将2毫升闪烁液放入小瓶中闪烁。
  9. 取出Whatman纸,将其放入闪烁液中。
  10. 放射性CO 2释放由闪烁体计数。

致谢

该协议改编自Fiaschi等人(2012)。

参考文献

  1. Fiaschi,T.,Marini,A.,Giannoni,E.,Taddei,ML,Gandellini,P.,De Donatis,A.,Lanciotti,M.,Serni,S.,Cirri,P.and Chiarugi, 2012)。 通过乳酸盐穿梭的交互代谢重编程协调影响肿瘤 - 基质相互作用。癌症 Res 72(19):5130-5140。
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引用:Fiaschi, T. and Chiarugi, P. (2013). Detection of Released CO2 by Radioactive Lactate. Bio-protocol 3(13): e813. DOI: 10.21769/BioProtoc.813.
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