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[Bio101] RNA Isolation from Arabidopsis Pollen Grains
[Bio101] 拟南芥花粉粒RNA的提取   

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本文章节

Abstract

This purpose of this experiment is to isolate high quality RNAs from pollen grains, which lays the foundation for further studies, like gene expression analysis and cDNA cloning.

Materials and Reagents

  1. Mannitol (Thermo Fisher Scientific/ VWR International)
  2. TRIzol reagent (Life Technologies, InvitrogenTM)
  3. Chloroform (Thermo Fisher Scientific)
  4. 75% ethanol
  5. Liquid nitrogen
  6. RNase-free water
  7. Isopropyl alcohol

Equipment

  1. Ceramic mortar and pestles
  2. Nanodrop (Thermo Fisher Scientific)
  3. Centrifuges (Eppendorf)
  4. Vortexer (VWR International)
  5. Fume hood
  6. 500 ml flask
  7. 50 ml falcon tubes
  8. 100 μm nylon mesh

Procedure

  1. Pollen collection:
    To collect mature pollen grains, stage 13 flowers (Sanders et al., 1999) should be used.
    1. Collect flowers and put into a 500 ml flask.
    2. Add 300 ml ice-cold 0.3 M mannitol.
    3. Hand-shake the flask vigorously for 2 min.
    4. Filter the pollen suspension through 100 μm nylon mesh.
    5. Collect pollen by centrifugation using 50 ml falcon tubes. (450 x g, 5 min, 4 °C). Repeat this step until all the pollen suspension is finished.
    6. Transfer pollen pellet into a 1.5 ml centrifuge tube. You can stop here by storing pollen at -80 °C , or proceed to the RNA isolation steps.

  2. Homogenization:
    1. Put into liquid N2.
    2. Homogenize pollen with mortar and pestles. Try to be as quick as possible at this step.
    3. Add TRIzol reagent (1 ml reagent/ 50-100 mg tissue, the sample volume should not exceed 10% of the volume of TRIzol used for homogenization, as suggested by the TRIzol protocol provided by the manufacturer). 

  3. Phase separation:
    1. Incubate the homogenized samples for 5 min at RT to permit the complete dissociation of nucleoprotein complexes.
    2. Add 0.2 ml of chloroform per 1 ml of TRIzol reagent under fume hood. Cap sample tubes securely.
    3. Shake tubes vigorously by hand for 15 sec and incubate them at RT for 2 to 3 min.
    4. Centrifuge the samples at no more than 12,000 x g for 15 min at 4 °C.
    5. Transfer the upper aqueous phase to a fresh tube. 

  4. RNA precipitation:
    1. Precipitate the RNA from the aqueous phase by mixing with isopropyl alcohol (Use 0.5 ml of isopropyl alcohol per 1 ml of TRIzol reagent used for the initial homogenization).
    2. Incubate samples at RT for 10 min.
    3. Centrifuge at no more than 12,000 x g for 10 min at 4 °C.
    4. Discard the supernatant.

  5. RNA wash:
    1. Wash the RNA pellet with 75% ethanol (use at least 1 ml of 75% ethanol per 1 ml of TRIzol reagent used for the initial homogenization).
    2. Mix the sample by vortexing.
    3. Centrifuge at no more than 7,500 x g for 5 min at 4 °C.
    4. Discard the supernatant. Now you get the RNA pellet at the tube bottom.

  6. Dissolving RNA:
    1. Briefly dry the RNA pellet on bench at RT (10-20 min).
    2. Dissolve RNA in RNase-free water by passing the solution in a few times through a pipette tip.
    3. Incubate at 55 to 60 °C for 10 min. Tap the tube several times during the incubation.
    4. Use Nanodrop to test the quantity and quality of the RNA.
    5. Store the RNA sample in -80 °C for future use.  

References

  1. Honys, D. and Twell, D. (2003). Comparative analysis of the Arabidopsis pollen transcriptome. Plant Physiol 132(2): 640-652.
  2. Lu, Y., Chanroj, S., Zulkifli, L., Johnson, M. A., Uozumi, N., Cheung, A. and Sze, H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.
  3. Sanders, P. M., Bui, A. Q., Weterings, K., McIntire, K. N., Hsu, Y. C., Lee, P. Y., Truong, M. T., Beals, T. P., Goldberg, R. B. (1999). Anther developmental defects in Arabidopsis thaliana male-sterile mutants. Sexual Plant Reproduction 11(6): 297-322.

简介

本实验的目的是从花粉粒中分离高质量的RNA,为进一步研究奠定基础,如基因表达分析和cDNA克隆。

材料和试剂

  1. 甘露醇(Thermo Fisher Scientific / VWR International)
  2. TRIzol试剂(Life Technologies,Invitrogen TM
  3. 氯仿(Thermo Fisher Scientific)
  4. 75%乙醇
  5. 液氮
  6. 无RNase的水
  7. 异丙醇

设备

  1. 陶瓷砂浆和杵
  2. Nanodrop(赛默飞世尔科技)
  3. 离心机(Eppendorf)
  4. Vortexer(VWR国际)
  5. 通风柜
  6. 500毫升烧瓶
  7. 50毫升猎鹰管
  8. 100微米尼龙网

程序

  1. 花粉收集:
    为了收集成熟的花粉,应使用13号花(Sanders等人,1999)。
    1. 收集花并放入500毫升烧瓶中。
    2. 加入300ml冰冷的0.3M甘露糖醇。
    3. 将烧瓶大力摇动2分钟。
    4. 通过100μm尼龙网过滤花粉悬浮液。
    5. 通过使用50ml的猎鹰管离心收集花粉。 (450×g,5分钟,4℃)。重复此步骤,直到所有花粉悬浮液完成。
    6. 将花粉粒转移到1.5ml离心管中。您可以通过在-80°C储存花粉来停止,或进行RNA分离步骤。

  2. 均匀化退火:
    1. 放入液体N 2
    2. 用砂浆和杵匀浆花粉。尽量在这一步尽可能快。
    3. 如制造商提供的TRIzol方案所示,加入TRIzol试剂(1ml试剂/ 50-100mg组织,样品体积不应超过用于均化的TRIzol体积的10%)。

  3. 相分离:
    1. 在室温下孵育匀浆样品5分钟以允许核蛋白复合物完全解离。
    2. 在通风橱下,每1ml TRIzol试剂中加入0.2ml氯仿。安全地盖上样品管。
    3. 用手剧烈摇动管15秒,并在室温下孵育2〜3分钟。
    4. 在4℃下将样品离心不超过12,000 x g 15分钟。
    5. 将上层水相转移到新鲜管中。

  4. RNA沉淀:
    1. 通过与异丙醇混合,从水相中沉淀RNA(每1ml用于初始均化的TRIzol试剂使用0.5ml异丙醇)。
    2. 在室温孵育10分钟。
    3. 在4℃下离心至不超过12,000 x g 10分钟。
    4. 丢弃上清液。

  5. RNA洗涤:
    1. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀(使用至少1ml 75%乙醇/ 1ml用于初始均化的TRIzol试剂)。
    2. 通过涡旋混合样品。
    3. 在4℃下离心至不超过7,500 x g 5分钟。
    4. 丢弃上清液。现在,您可以在管底部获得RNA颗粒。

  6. 溶解RNA:
    1. 在室温下将RNA颗粒短暂干燥(10-20分钟)。
    2. 通过将溶液通过移液管吸头几次,将RNA溶解在无RNase的水中。
    3. 在55至60℃孵育10分钟。在孵育期间点击管数次。
    4. 使用Nanodrop测试RNA的数量和质量。
    5. 将RNA样品储存在-80°C以备将来使用。   

参考

  1. Honys,D.和Twell,D。(2003)。  拟南芥花粉转录组的比较分析。植物生理学132(2):640-652。
  2. Lu,Y.,Chanroj,S.,Zulkifli,L.,Johnson,MA,Uozumi,N.,Cheung,A. and Sze,H。(2011)。缺乏一对K +转运蛋白的花粉管不能在拟南芥中靶向胚珠。植物细胞 23(1):81-93。
  3. Sanders,PM,Bui,AQ,Weterings,K.,McIntire,KN,Hsu,YC,Lee,PY,Truong,MT,Beals,TP,Goldberg,RB(1999)。  拟南芥雄性不育突变体中的花药发育缺陷 性 植物繁殖 11(6):297-322。
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Lu, Y. (2011). RNA Isolation from Arabidopsis Pollen Grains. Bio-protocol Bio101: e67. DOI: 10.21769/BioProtoc.67;
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