搜索

[Bio101] Rabbit IgG Conjugation to Dynabeads
[Bio101] 将兔子IgG交联到免疫磁珠   

下载 PDF 引用 收藏 1 提问与回复 分享您的反馈 Cited by

本文章节

Abstract

This method couples rabbit IgG (or any other proteins serve as affinity reagent) to the surface of magnetic beads (Brand name: Dynabeads). The amine and thiol groups of amino acid residues on the protein are covalently linked with the epoxy group on Dynabeads. The coupled IgG beads can be stored at 4°C for 6-12 month with no obvious loss in reactivity.

Keywords: Dynabeads(免疫磁珠), Immunoglobulin G(免疫球蛋白G), Conjugation(结合), Immunoprecipitation(免疫沉淀), Affinity purification(亲和纯化)

 

Materials and Reagents

  1. Invitrogen Conjulation kit (143.11D), contains C1, C2, HB, LB, SB solutions
  2. IgG (Sigma-Aldrich, catalog number: I5006-10 mg )
  3. Dynabeads M-270 Epoxy 300 mg (Life Technologies, Invitrogen™)
  4. Phosphate buffered saline (PBS) tablet
  5. 30% NaN3 (fresh)
  6. 20% Tween 20

Equipment

  1. Hula mixer (Life Technologies, Invitrogen™) or other rocker capable of 360° rotation
  2. Magnet for 15 ml tubes
  3. Spectrometer

Procedure

Day 1

  1. Dissolve rabbit IgG in cold 1x PBS to a final concentration of 10 mg/ml.
  2. Centrifuge the rabbit IgG at 14,000 rpm for 10 min at 4 °C, and save the supernatant. 
  3. Determine the IgG concentration using the Bradford method on a spectrometer. 
  4. Add 5 ml C1 of the Conjulation Kit to the 300 mg dynabeads and mix by pipetting in the original glass vial. Then transfer to a 15 ml tube. Add C1 to 12 ml, split to another three 15 ml tubes, each tube with 3 ml beads.
  5. Remove the supernatant from the tube on a magnet.
  6. Add 300 μl rabbit IgG from step 1, 2.7 ml C1 to the beads, mix by pipetting.
  7. Add 3 ml C2 and mix by pipetting again.
  8. Wrap in aluminum foil and incubate at 37 °C for 16-24 h on Hula mixer set at 15-20 rpm.

Day 2

  1. Centrifuge 1,000 x g, 5 min. Remove the supernatant (save supernatant for calculation of protein conjulation efficiency).
  2. Wash each tube with 1,000 μl HB in each tube (add HB, then transfer to a 2 ml tube).  Combine supernatant.
  3. Wash each tube with 1,000 μl LB. Combine supernatant.
  4. Wash each tube with 1,000 μl SB. Combine supernatant.
  5. Wash each tube with 1,000 μl SB and incubate at room temperature (RT) for 15 min.  Combine supernatant.
  6. Wash each tube with 1,000 μl PBS+0.05% Tween at RT for 10 min x 3 times.
  7. Resuspend beads in each tube with 2 ml SB, add NaN3 to final concentration of 0.02%. Then split each tube of beads (400 μl) to 5 tubes containing 600 μl SB each with 0.02% NaN3.

References

  1. Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M. and Snyder, M. (2010). Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses. Cell 143(4): 639-650.

简介

该方法将兔IgG(或任何其他蛋白质用作亲和试剂)偶联至磁珠(商品名:Dynabeads)的表面。 蛋白质上的氨基酸残基的胺基和硫醇基与Dynabeads上的环氧基共价连接。 偶联的IgG珠可以在4℃下储存6-12个月,没有明显的反应性损失。

关键字:免疫磁珠, 免疫球蛋白G, 结合, 免疫沉淀, 亲和纯化

 

材料和试剂

  1. Invitrogen Conjulation试剂盒(143.11D),含有C1,C2,HB,LB,SB溶液
  2. IgG(Sigma-Aldrich,目录号:I5006-10mg)
  3. Dynabeads M-270环氧树脂300mg(Life Technologies,Invitrogen TM)
  4. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)片
  5. 30%NaN 3(新鲜)
  6. 20%Tween 20

设备

  1. Hula混合器(Life Technologies,Invitrogen TM)或能够360°旋转的其它摇杆
  2. 磁铁为15毫升管
  3. 光谱仪

程序

第1天

  1. 将兔IgG溶于冷的1x PBS中至终浓度为10mg/ml。
  2. 将兔IgG在4℃以14,000rpm离心10分钟,并保存上清液。
  3. 使用Bradford方法在光谱仪上确定IgG浓度。
  4. 添加5毫升C1的Conjulation试剂盒到300毫克dynabeads和混合通过移液在原来的玻璃小瓶。 然后转移到15ml管。 加入C1至12ml,分成另外三个15ml管,每个管用3ml珠。
  5. 在磁铁上除去管中的上清液。
  6. 加入300μl来自步骤1的兔IgG,2.7ml C1到珠子,通过吸移混合。
  7. 加入3毫升C2,再次通过吸移混合。
  8. 包裹在铝箔中,并在37℃下在Hula搅拌器上设定在15-20rpm下孵育16-24小时

第2天

  1. 离心1,000×g/g,5分钟。 除去上清液(保存上清液用于计算蛋白质结合效率)。
  2. 用每管1000μlHB洗涤每管(加入HB,然后转移到2ml管)。 合并上清液。
  3. 用1000μlLB洗涤每个管。 合并上清液。
  4. 用1000μlSB洗涤每个管。 合并上清液。
  5. 用1000μlSB洗涤每个管,并在室温(RT)孵育15分钟。 合并上清液。
  6. 用1000μlPBS + 0.05%Tween在室温下洗涤每个管10分钟×3次。
  7. 在每个管中用2ml SB重悬细胞,加入NaN 3至终浓度为0.02%。 然后将每个珠子(400μl)分成5个含有600μlSB(各含0.02%NaN 3)的管。

参考文献

  1. Li,X.,Gianoulis,T.A.,Yip,K.Y.,Gerstein,M。和Snyder,M。(2010)。 体内广泛的代谢物 - 蛋白质相互作用通过大规模系统分析揭示 。 Cell 143(4):639-650。
  • English
  • 中文翻译
免责声明 × 为了向广大用户提供经翻译的内容,www.bio-protocol.org 采用人工翻译与计算机翻译结合的技术翻译了本文章。基于计算机的翻译质量再高,也不及 100% 的人工翻译的质量。为此,我们始终建议用户参考原始英文版本。 Bio-protocol., LLC对翻译版本的准确性不承担任何责任。
Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Li, X. (2011). Rabbit IgG Conjugation to Dynabeads. Bio-protocol Bio101: e63. DOI: 10.21769/BioProtoc.63;
提问与回复

(提问前,请先登录)bio-protocol作为媒介平台,会将您的问题转发给作者,并将作者的回复发送至您的邮箱(在bio-protocol注册时所用的邮箱)。为了作者与用户间沟通流畅(作者能准确理解您所遇到的问题并给与正确的建议),我们鼓励用户用图片或者视频的形式来说明遇到的问题。由于本平台用Youtube储存、播放视频,作者需要google 账户来上传视频。

当遇到任务问题时,强烈推荐您提交相关数据(如截屏或视频)。由于Bio-protocol使用Youtube存储、播放视频,如需上传视频,您可能需要一个谷歌账号。


Dear Sir,
could you please help us with protocol purification of IgG immunoglobulin for commercial set up.
kindly do the needful

Awaiting your reply,
Regards,
Shruti Trivedi
3/24/2012 12:22:29 AM Reply