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[Bio101] Single Worm PCR
[Bio101] 单蠕虫PCR   

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本文章节

Abstract

This protocol is used for genotyping single worms.

Materials and Reagents

  1. Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, catalog number: 74385 )
  2. Gelatin (Sigma-Aldrich)
  3. Proteinase K (Promega Corporation, catalog number: V3021 )
  4. KCl
  5. Tris (pH 8.3)
  6. MgCl2
  7. Nonidet P-40
  8. Tween-20
  9. Gelatinin
  10. Lysis buffer (see Recipes)

Equipment

  1. PCR tubes

Procedure

  1. Transfer one adult worm directly from a plate to 5 μl of lysis buffer in each PCR tube.
    Note: To avoid transferring a large amount of bacteria, pick worm from region away from bacterial lawn. Also, try not to pick an old worm or starving worm.
  2. Spin capped PCR tubes briefly to bring down worm to the bottom of the tube.
  3. Freeze at -80 °C for 10 min or longer (up to a week).
  4. Lyse the worms for release of genomic DNA.
  5. Heat sample at 60 °C for 1 h, then inactivate protease K at 95 °C for 15 min. Store the worm DNA at -80 °C (or -20 °C for temporary storage) if needed.
  6. Perform standard PCR reaction, use 5 μl worm DNA as template for 50 μl reaction.

Notes

  1. Lysis buffer
    50 mM KCl
    10 mM Tris (pH 8.3)
    2.5 mM MgCl2
    0.45% Nonidet P-40
    0.045% Tween-20
    0.01% (w/v) gelatinin
    Autoclave and store at 4 °C (good for more than 6 months) or -20 °C for long-term storage. Right before use, add proteinase K stock to the lysis buffer with final concentration 60 μg ml-1.

References

  1. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R. and Waterston, R. H. (1992). A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics 131(3): 609-624.

简介

此协议用于基因分型单个蠕虫。

材料和试剂

  1. Nonidet P-40(Sigma-Aldrich,目录号:74385)
  2. 明胶(Sigma-Aldrich)
  3. 蛋白酶K(Promega Corporation,目录号:V3021)
  4. KCl
  5. Tris(pH 8.3)
  6. MgCl 2
  7. Nonidet P-40
  8. 吐温-20
  9. 明胶
  10. 裂解缓冲液(见配方)

设备

  1. PCR管

程序

  1. 将一个成虫直接从板转移到每个PCR管中的5μl裂解缓冲液 注意:为了避免转移大量的细菌,从区域摘除虫从细菌草坪。 此外,尽量不要选择一个老的蠕虫或挨饿的蠕虫。
  2. 旋转加盖PCR管短暂地把蠕虫带到管的底部
  3. 在-80℃冷冻10分钟或更长时间(长达一周)。
  4. 溶解蠕虫的基因组DNA释放。
  5. 热样品在60℃下1小时,然后灭活蛋白酶K在95℃15分钟。 将蠕虫DNA存储在-80°C(或-20°C暂时存储),如果需要
  6. 执行标准PCR 反应,使用5μl蠕虫DNA作为模板 50μl反应

笔记

  1. 裂解缓冲液
    50 mM KCl
    10mM Tris(pH8.3) 2.5mM MgCl 2 v/v 0.45%Nonidet P-40
    0.045%Tween-20 0.01%(w/v)明胶素 高压灭菌并储存在4°C(好于6个月以上)或-20°C长期储存。 在使用前,将蛋白酶K原液加入到最终浓度为60μg/ml 的裂解缓冲液中。

参考文献

  1. Williams,B.D.,Schrank,B.,Huynh,C.,Shownkeen,R.and Waterston,R.H。(1992)。 基于多态性序列标记位点的秀丽隐杆线虫中的遗传作图系统 Genetics 131(3):609-624。
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:He, F. (2011). Single Worm PCR. Bio-protocol Bio101: e60. DOI: 10.21769/BioProtoc.60;
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Miseon Seong
Central Baptist College
I saw another protocol which said to use 0.45% Tween-20 instead of 0.045%. Could you confirm the concentration for me? It might not matter, but just in case :) Thank you so much!
11/17/2014 9:26:10 AM Reply
Fanglian He
University of Pennsylvania

Hi Miseon,

Thanks for pointing out. It was a typo--should be 0.45% Tween-20. It has been corrected now.

11/22/2014 8:23:45 AM