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Western Analysis of Histone Modifications (Aspergillus nidulans)
Western检测组蛋白(巢状曲霉)的修饰   

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Abstract

Western blotting allows for the specific detection of proteins and/or modifications of proteins by an antibody of interest. This protocol utilizes a crude nuclei extraction protocol for Aspergillus nidulans to enrich for histones and other nuclear proteins prior to gel electrophoresis. Post translational modifications of histones may then be easily detected. After electrophoresis, the selected antibodies are used to detect and quantify levels of the modifications of interest.

Keywords: Histone H4(H4组), Epigenetics(epigenetics), Histone H3(组蛋白H3)

Materials and Reagents

  1. D-glucose
  2. NaNO3
  3. KCl
  4. MgSO4.7H2O
  5. KH2PO4
  6. ZnSO4.7H2O
  7. H3BO3
  8. MnCl2.4H2O
  9. FeSO4.7H2O
  10. CoCl2.5H2O
  11. CuSO4.5H2O
  12. (NH4)6Mo7O24.4H2O
  13. EDTA
  14. Spermine
  15. Spermidine
  16. PMSF
  17. Sorbitol
  18. Halt Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher Scientific, catalog number: PI-78437 )
  19. NaCl
  20. KCl
  21. Tris base
  22. Glycine
  23. Methanol
  24. Bio-Rad protein assay (Bio-Rad Laboratories, catalog number: 500-0006 )
  25. Miracloth (Calbiochem, catalog number: 475855 )
  26. Rabbit polyclonal antibody to histone H4 acetyl K5 (1:2,500) (Abcam, catalog number: ab51997 )
  27. Rabbit polyclonal antibody to histone H4 acetyl K8 (1:2,500) (Abcam, catalog number: ab15823 )
  28. Rabbit polyclonal antibody to human C-terminus histone H4 antibody (1:2,500) (Abcam, catalog number: ab10158 )
  29. Mouse monoclonal antibody to TATA Binding Protein (TBP) (1:1,000) (Abcam, catalog number: ab61411 )
  30. Mouse monoclonal antibody to pan acetyl H4 (1:1,000) (Active Motif, catalog number: 39925 )
  31. Goat anti-mouse alkaline phosphatase conjugated antibody (1:5,000) (Life Technologies, Gibco®, catalog number: 13864-012 )
  32. Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated antibody (1:5,000) (Pierce Antibodies, catalog number: 31342 )
  33. 1-Step NBT/BCIP (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 34042 )
  34. Glucose Minimal Medium (GMM) (see Recipes)
  35. 2x Laemmli  buffer (see Recipes)
  36. Nuclear Isolation buffer (see Recipes)
  37. Resuspension buffer (see Recipes)
  38. ST buffer (see Recipes)
  39. TBS-T (see Recipes)
  40. Western transfer buffer (see Recipes)
  41. Media Recipes (see Recipes)

Equipment

  1. Mortar and pestle
  2. Bio-Rad Mini-Protean gel electrophoresis system (Bio-Rad Laboratories, catalog number: 170-3940 )
  3. Semi-Dry Blotter (Bio-Rad Laboratories, catalog number: 170-3940)
  4. Orbital shaker
  5. 15 ml Falcon tubes
  6. 50 ml Falcon tubes
  7. 30 ml centrifuge tubes
  8. Microfuge tubes

Procedure

  1. Nuclear extract:
    Note: All nuclear isolation steps and solutions should be kept on ice.
    1. Inoculate 250 ml of liquid glucose minimal medium (GMM) to a final concentration of 1 x 106 spores/ml and incubate at 37 °C, 250 rpm for 48 h.
    2. Collect mycelia by vacuum filtration through two layers of miracloth. Remove excess moisture by squeezing in between paper towels.
    3. Place mycelia into a 15 ml Falcon tube and flash freeze in liquid nitrogen. After freezing, grind mycelia to a fine powder with a mortar and pestle under liquid nitrogen.
    4. Transfer ~5 g ground mycelia to 50 ml Falcon tubes.
    5. Add 40 ml of ice cold Nuclear Isolation buffer and vortex to mix.
    6. Centrifuge for 10 min at 1,000 x g, 4 °C. Filter supernatant through a double layer of miracloth into 30 ml centrifuge tubes.
    7. Centrifuge for 10,000 x g for 15 min, 4 °C.
    8. Discard supernatant and resuspend pellet in 10 ml of ice cold Resuspension buffer.
    9. Centrifuge for 10,000 x g for 15 min, 4 °C.
    10. Discard supernatant and resuspend pellet in 1 ml of ice-cold ST buffer.
    11. Transfer suspension into 1.5 ml centrifuge tube and pellet debris by centrifugation at 4,000 x g for 30 sec, room temperature.
    12. Transfer supernatant into a sterile 1.5 ml centrifuge tube. Store at -20 °C if desired.
    13. Quantify protein levels using Bio-Rad Protein Assay or equivalent.
  2. Western blotting:
    1. Load standardized amount of protein per sample (e.g. 50 μg) onto an SDS-PAGE gel with appropriate sample loading buffer (such as Laemmli 2x sample buffer).
      1. I used 10% Tricine-SDS-PAGE, cast according to Schägger (2006), and the Bio-Rad Mini Protean gel electrophoresis system.
    1. Transfer to nitrocellulose membrane by electroblotting using the Bio-Rad Semi-Dry Blotter (can be done at room temperature).
      1. Soak your gel in western transfer buffer for 30 min and soak the nitrocellulose membrane in western transfer buffer for 10 min before blotting.
      2. Soak extra thick blotting paper in western transfer buffer–construct the “sandwich” according to the semi-dry transfer manual. From the bottom (+ pole) working to the top (- pole): Extra thick blotting paper, nitrocellulose membrane, acrylamide gel, extra thick blotting paper.
      3. Assemble apparatus and run at 15 V for 1 h.
    1. Block membranes for 1 h at room temperature on an orbital shaker using 5% nonfat dry milk in TBS-T.
    2. Incubate with primary antibodies for 1 h in TBS-T. 10 ml is sufficient for a small blot. Incubation may also be performed at 4 °C, especially if planning to reuse primary antibody solutions.
    3. Pour off the primary antibody solutions. Primary antibody solutions may be reused up to 5 times, although antibody concentration will decrease with each use. (note: These solutions contain sodium azide as preservative).
    4. Wash 3 x 10 min in TBS-T. Apply secondary antibodies in TBS-T for 1 h at room temperature. 10 ml is sufficient for a small blot.
    5. Pour off secondary antibody solution (no need to retain). Wash blots 3 x 10 min in TBS-T at room temperature on the orbital shaker.
    6. Add One-step NBP/BCIP developing solution and agitate gently. Keep an eye on the signal intensity, it will only be a matter of minutes to develop and development time will be different for each antibody. When reaches desired intensity (or just before), pour off the developing solution and rinse in several changes of distilled water. Incubate in ddH2O for ~20 min.
      (Note: NBP/BCIP developer results precipitation of a colored substance on the membrane, thus, membranes cannot be stripped and reprobed. If intending to reprobe the membrane, alternative secondary antibodies (e.g. HRP or fluorescent conjugated) should be used.)
    7. Blots can be dried on bench to preserve. Signal will fade upon direct exposure to light.

Recipes

  1. 2x Laemmli buffer (1 ml)
    4% SDS   
    400 µl of 10% SDS
    10% 2-mercaptoehtanol
    100 µl
    20% glycerol
    200 µl
    0.004% bromophenol blue
    40 µl of saturated solution (0.1%)
    0.125 M Tris HCl
     125 µl of 1 M Tris HCl (pH 6.8)
    Bring to 1 ml with water.
  2. Nuclear Isolation buffer (1 L) 
    1 M Sorbitol
    182.2 g
    10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    10 ml of 1 M Tris-HCl
    10 mM EDTA
     20 ml of 0.5 M EDTA
    Autoclave, then add the following:
    0.15 mM Spermine
    52.2 mg
    0.5 mM Spermidine
    127 mg
    Right before use, add:
    2.5 mM PMSF
    435 mg
    Note: PMSF has a short half-life in aqueous solutions, 30-100 min.
  3. Resuspension buffer 1 L 500 ml
    1 M Sorbitol
    182.2 g
    91.1 g
    10 mM Tris-HCl pH 7.5
    10 ml of 1M Tris-HCl
    5 ml   
    1 mM EDTA
    2 ml of 0.5 M EDTA
    1 ml
    Autoclave, then add the following:
    0.15 mM Spermine
    52.2 mg   
    26.1 mg
    0.5 mM Spermidine
    127 mg   
    63.5 mg
    Right before use, add (optional):
    2.5 mM PMSF
    435 mg   
    218 mg

  4. ST buffer 100 ml
    1 M Sorbitol
    18.2 g
    10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 ml of 1 M Tris-HCl
    Autoclave.
    Add Protease Inhibitor Cocktail right before use at 10 μl per 1 ml.
  5. TBS-T 1 L           
    NaCl
    8 g
    KCl
    0.2 g
    Tris base
    3 g
    Mix in ~ 800 ml dH2O, adjust pH to 7.4 with HCl, then adjust volume to 1 L.
    Autoclave
    After cooling, add 1 ml Tween 20.
  6. Western transfer buffer  1 L  9 L
    Tris base
    3.03 g
    27.3 g
    Glycine   
    14.4 g
    129.6 g
    Methanol
    200 ml
    1.8 L
    Adjust volume to correct volume with dH2O
    Store at 4 °C for up to 1 month
  7. Media Recipes
    Glucose Minimal Medium (GMM)
    20x sodium nitrate salts*
    50 ml/L
    Trace elements (shake before using)
    1 ml/L
    D-glucose
    10 g/L
    Adjust pH to 6.5
    Add ddH2O up to one liter
    Autoclave 15 min, 121 °C
    *20x sodium nitrate salts solution
    NaNO3 
    120 g
    KCl
    10.4 g
    MgSO4.7H2O
    10.4 g
    KH2PO4
    30.4 g
    Add ddH2O up to 1 L
    Autoclave and store at room temperature.
    **Trace elements
    ZnSO4•7H2O
    2.2 g
    H3BO3
    1.1 g
    MnCl2•4H2
    0.5 g
    FeSO4•7H2O
    0.5 g
    CoCl2•5H2O
    0.16 g
    CuSO4•5H2O
    0.16 g
    (NH4)6Mo7O24•4H2O
    0.11g
    Na4EDTA 
    5.0g
    Add the solids in order to 80 ml of H2O, dissolving each completely before adding the next. Heat the solution to boiling, cool to 60 °C. Adjust the pH to 6.5-6.8 with KOH pellets. Cool to room temperature and adjust volume to 100 ml with ddH2O.

References

  1. Palmer, J. M., Perrin, R. M., Dagenais, T. R. and Keller, N. P. (2008). H3K9 methylation regulates growth and development in Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell 7(12): 2052-2060. 
  2. Schagger, H. (2006). Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc 1(1): 16-22.  
  3. Soukup, A. A., Chiang, Y. M., Bok, J. W., Reyes-Dominguez, Y., Oakley, B. R., Wang, C. C., Strauss, J. and Keller, N. P. (2012). Overexpression of the Aspergillus nidulans histone 4 acetyltransferase EsaA increases activation of secondary metabolite production. Mol Microbiol 86(2): 314-330.

简介

蛋白质印迹允许由感兴趣的抗体特异性检测蛋白质和/或蛋白质的修饰。 该方案在凝胶电泳之前利用构巢曲霉的粗核提取方案来富集组蛋白和其它核蛋白。 然后可以容易地检测组蛋白的翻译后修饰。 电泳后,所选择的抗体用于检测和定量感兴趣的修饰的水平。

关键字:H4组, epigenetics, 组蛋白H3

材料和试剂

  1. D-葡萄糖
  2. NaNO 3
  3. KCl
  4. MgSO 4。 。 O
  5. KH 2 PO 4
  6. ZnSO 4 。 7H O
  7. H 3 BO 3
  8. MnCl 2 4H O
  9. FeSO 4 7H <2> O
  10. CoCl <2> 5H 2 O
  11. CuSO 4 5H sub 2 O
  12. (NH 4)6 Mo 7+ O 24+。在本发明的一个实施方案中, O
  13. EDTA
  14. 精胺
  15. 亚精胺
  16. PMSF
  17. 山梨醇
  18. Halt蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific,目录号:PI-78437)
  19. NaCl
  20. KCl
  21. Tris碱
  22. 甘氨酸
  23. 甲醇
  24. Bio-Rad蛋白质测定(Bio-Rad Laboratories,目录号:500-0006)
  25. Miracloth(Calbiochem,目录号:475855)
  26. 针对组蛋白H4乙酰基K5(1:2,500)的兔多克隆抗体(Abcam,目录号:ab51997)
  27. 针对组蛋白H4乙酰基K8(1:2,500)的兔多克隆抗体(Abcam,目录号:ab15823)
  28. 针对人C末端组蛋白H4抗体的兔多克隆抗体(1:2,500)(Abcam,目录号:ab10158)
  29. 针对TATA结合蛋白(TBP)(1:1,000)的小鼠单克隆抗体(Abcam,目录号:ab61411)
  30. 泛酰乙酰H4(1:1000)(Active Motif,目录号:39925)的小鼠单克隆抗体
  31. 山羊抗小鼠碱性磷酸酶缀合的抗体(1:5,000)(Life Technologies,Gibco ,目录号:13864-012)
  32. 山羊抗兔碱性磷酸酶偶联的抗体(1:5,000)(Pierce Antibodies,目录号:31342)
  33. 1步NBT/BCIP(Thermo Fisher Scientific,目录号:34042)
  34. 葡萄糖最小培养基(GMM)(参见食谱)
  35. 2x Laemmli  缓冲区(请参阅配方)
  36. 核隔离缓冲区(参见配方)
  37. 重悬缓冲液(见配方)
  38. ST缓冲区(参见配方)
  39. TBS-T(参见配方)
  40. Western传输缓冲区(请参阅配方)
  41. 媒体食谱(见配方)

设备

  1. 砂浆和杵
  2. Bio-Rad Mini-Protean凝胶电泳系统(Bio-Rad Laboratories,目录号:170-3940)
  3. 半干印迹仪(Bio-Rad Laboratories,目录号:170-3940)
  4. 轨道振动器
  5. 15 ml Falcon管
  6. 50ml Falcon管
  7. 30 ml离心管
  8. Microfuge管

程序

  1. 核提取物:
    注意:所有的核隔离步骤和解决方案都应保存在冰上。
    1. 接种250ml液体葡萄糖基本培养基(GMM)至终浓度为1×10 6孢子/ml,并在37℃,250rpm培养48小时。
    2. 通过真空过滤通过两层miracloth收集菌丝体。 通过在纸巾之间挤压去除多余的水分。
    3. 将菌丝体放入15毫升Falcon管中,在液氮中快速冷冻。 冷冻后,在液氮下用研钵和研杵将菌丝体研磨成细粉。
    4. 转移〜5克地面菌丝至50毫升Falcon管
    5. 加入40ml冰冷的核分离缓冲液并涡旋混合。
    6. 在1,000×g离心10分钟,4℃。 通过双层miracloth过滤上清液到30ml离心管中。
    7. 在4℃下离心10,000分钟,15分钟。
    8. 弃去上清液并将沉淀物重悬于10ml冰冷的重悬缓冲液中
    9. 在4℃下离心10,000分钟,15分钟。
    10. 弃去上清液,并在1ml冰冷的ST缓冲液中重悬沉淀
    11. 将悬浮液转移到1.5ml离心管中,并通过在4,000×g离心30分钟,室温下沉淀碎片。
    12. 将上清液转移到无菌的1.5ml离心管中。 如有需要,存放于-20°C
    13. 使用Bio-Rad Protein Assay或等同物定量蛋白质水平。
  2. Western印迹:
    1. 用适当的样品上样缓冲液(例如Laemmli 2×样品缓冲液)将标准量的每个样品(例如50μg)加载到SDS-PAGE凝胶上。
      1. 我使用根据Schägger(2006)和Bio-Rad Mini Protean凝胶电泳系统进行的10%Tricine-SDS-PAGE。
    1. 通过使用Bio-Rad半干燥印迹仪的电印迹(可以在室温下进行)转移到硝酸纤维素膜。
      1. 浸泡你的凝胶在西部转移缓冲液中30分钟,将硝化纤维素膜浸泡在西方转移缓冲液中10分钟,之后吸干。
      2. 在西方转移缓冲液中浸泡超厚的吸墨纸 - 根据半干转移手册构建"三明治"。从底部(+极)工作到顶部( - 极):超厚吸墨纸,硝酸纤维素膜,丙烯酰胺凝胶,超厚吸墨纸。
      3. 装配设备,在15 V运行1小时。
    1. 在使用5%脱脂奶粉的TBS-T中的定轨振荡器上室温封闭膜1小时。
    2. 与一抗在TBS-T中孵育1小时。 10ml对于小印迹是足够的。 也可以在4℃下进行孵育,特别是如果计划重复使用一抗溶液。
    3. 倒掉一抗溶液。 初级抗体溶液可重复使用多达5次,尽管抗体浓度随每次使用而降低。 ( n ote:这些溶液含有叠氮化钠作为防腐剂。
    4. 在TBS-T中洗涤3×10分钟。应用二抗在TBS-T在室温下1小时。 10 ml足以进行小印迹
    5. 倒出二抗溶液(不需要保留)。在室温下在轨道摇床上在TBS-T中洗涤3×10分钟
    6. 加入一步NBP/BCIP显影液,轻轻搅拌。保持眼睛的信号强度,它只会是几分钟的发展和开发时间将是不同的每个抗体。当达到所需强度(或刚好在之前),倒出显影溶液,并在几次更换蒸馏水冲洗。在ddH 2 O中孵育〜20分钟。
      (注意:NBP/BCIP显影剂导致有色物质在膜上沉淀,因此,膜不能被剥离和重新探查。如果打算重新扫描膜,应当使用替代的第二抗体(例如HRP或荧光缀合的)。 )
    7. 印迹可以在台上干燥以保存。在直接暴露于光线下,信号会消失。

食谱

  1. 2×Laemmli缓冲液(1ml)
    4%SDS   
    400μl10%SDS
    10%2-巯基乙醇 100微升
    20%甘油 200μl
    0.004%溴酚蓝
    40μl饱和溶液(0.1%)
    0.125M Tris HCl
    &125μl1M Tris HCl(pH 6.8)
    用水稀释至1ml。
  2. 核分离缓冲液(1 L)
    1 M山梨醇 182.2克
    10mM Tris-HCl(pH7.5) 10ml的1M Tris-HCl
    10 mM EDTA
    ·20ml 0.5M EDTA
    高压灭菌,然后添加以下内容:
    0.15mM精胺
    52.2mg
    0.5 mM亚精胺 127 mg
    使用前,请添加:
    2.5 mM PMSF
    435 mg
    注意:PMSF在水溶液中的半衰期短,为30-100分钟。
  3. 重悬缓冲液1 L 500 ml
    1 M山梨醇 182.2克
    91.1克
    10mM Tris-HCl pH7.5
    10ml 1M Tris-HCl
    5 ml   
    1mM EDTA
    2ml 0.5M EDTA
    1 ml
    高压灭菌,然后添加以下内容:
    0.15mM精胺
    52.2毫克   
    26.1mg
    0.5 mM亚精胺 127 mg   
    63.5毫克
    在使用之前,添加(可选):
    2.5 mM PMSF
    435 mg   
    218 mg

  4. ST缓冲液100 ml
    1 M山梨醇 18.2克
    10mM Tris-HCl(pH7.5) 1ml 1M Tris-HCl
    高压灭菌。
    在使用前加入蛋白酶抑制剂混合物,每1ml加10μl
  5. TBS-T 1 L          
    NaCl
    8克
    KCl
    0.2 g
    Tris碱
    3克
    在〜800ml dH 2 O中混合,用HCl调节pH至7.4,然后将体积调节至1L。
    高压灭菌器
    冷却后,加入1ml吐温20.
  6. 西部传输缓冲区  1 L  9 L
    Tris碱
    3.03克
    27.3克
    甘氨酸   
    14.4 g
    129.6克
    甲醇
    200 ml
    1.8 L
    用dH <2> O调整音量以校正音量
    储存于4°C长达1个月
  7. 媒体配方
    葡萄糖最小培养基(GMM)
    20x硝酸钠盐 *
    50 ml/L
    微量元素(使用前摇动)
    1 ml/L
    D-葡萄糖
    10 g/L
    将pH调节至6.5
    添加ddH2O到一升
    高压灭菌15分钟,121℃
    * 2 Ox硝酸钠溶液
    NaNO 3
    120克
    KCl
    10.4克
    MgSO 4·7H 2 O 2·h/v 10.4 g
    KH 2 PO 4
    30.4克
    将ddH <2> O添加到1 L
    高压灭菌并在室温下储存。
    ** T 比赛元素
    ZnSO 4·7H 2 O·n/2 2.2 g
    H 3 BO 3
    1.1克
    MnCl 2·4H 2 O ...
    0.5克
    FeSO 4·7H 2 O·m/2 0.5克
    CoCl 2·5H 2 O·m/2 0.16 g
    CuSO 4·5H 2 O·m/2 0.16 g
    (NH 4)6 Mo 6 Mo 7 Au 24 CH 4 O 2 br /> 0.11g
    Na EDTA
    5.0g
    加入固体以得到80ml的H 2 O,在加入下一个之前完全溶解每一个。 将溶液加热至沸腾,冷却至60℃。 用KOH颗粒调节pH至6.5-6.8。 冷却至室温,并用ddH 2 O调节体积至100ml。

参考文献

  1. Palmer,J.M.,Perrin,R.M.,Dagenais,T.R.and Keller,N.P。(2008)。 H3K9甲基化 调节烟曲霉中的生长和发育。 Eukaryot Cell 7(12):2052-2060。
  2. Schagger,H。(2006)。 Tricine-SDS-PAGE。 Nat Protoc 1(1):16-22。  
  3. Soukup,A.A.,Chiang,Y.M.,Bok,J.W.,Reyes-Dominguez,Y.,Oakley,B.R.,Wang,C.C.,Strauss,J.and Keller,N.P.(2012)。 构巢曲霉组蛋白4乙酰转移酶的过度表达EsaA增加次级代谢产物的激活。 Mol Microbiol 86(2) :314-330。
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Copyright: © 2013 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Soukup, A. and Keller, N. P. (2013). Western Analysis of Histone Modifications (Aspergillus nidulans). Bio-protocol 3(7): e424. DOI: 10.21769/BioProtoc.424.
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