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[Bio101] Antibody Affinity Purification
[Bio101] 抗体亲和纯化

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本文章节

Abstract

Antibody purification is performed to concentrate and enrich antigen-specific antibodies and lower the background signal during detection by removing any non-specific proteins. Affinity purification makes use of specific binding interactions between molecules, and is very simple and efficient.

Materials and Reagents

  1. PBS
  2. NaCl
  3. KCl
  4. Na2HPO4
  5. KH2PO4
  6. Glycine
  7. HCl
  8. Tris-HCl
  9. BSA
  10. Azide
  11. Affinity resin
  12. Sepharose
  13. 10x PBS (see Recipes)
  14. 1x PBS + 1 M NaCl (see Recipes)
  15. 0.1 M glycine-HCl (pH 2.8) (see Recipes)
  16. 1 M Tris- HCl (pH 8.5) (see Recipes)

Equipment

  1. Centrifuges
  2. Affinity resin
  3. Spectrometer

Procedure

  1. Mix serum with affinity resin (protein coupled to sepharose). If using whole serum, dilute 1: 10 with PBS. Incubate overnight with gentle agitation.
  2. Pour resin into column and collect the flow through. This is 1x pre-absorbed immune serum.
  3. Wash the column with 1x PBS (pH 7.5) until the OD280 is zero.
  4. Wash the column with PBS + 1 M NaCl to elute non-specifically absorbed material until the OD280 is zero.
  5. Wash the column with PBS until the OD280 is zero.
  6. Wash the column with 10 volume of 0.1 M glycine-HCl to elute specifically bound material. The acid eluant is neutralized by placing an aliquot (1/10 of fraction volume) of 1 M Tris-HCl (pH 8.5) into the fraction collection tubes. This is done prior to elution with acid. Collect the entire trailing peak-the highest affinity antibodies are released most slowly.
  7. Wash the column with PBS until the OD280 is zero.
  8. Pool the anitbody fractions and dialyze overnight against PBS/azide. After dialysis, check the OD, add BSA to 1%, aliquot and store at -70 °C.

Recipes

  1. 10x PBS (pH 7.5)
    40 g NaCl
    1 g KCl
    7.2 g Na2HPO4
    1.2 g KH2PO4
    500 ml
  2. 1x PBS + 1 M NaCl
    25 ml 10x PBS
    14.61 g NaCl
    250 ml
  3. 0.1 M glycine-HCl (pH 2.8)
    0.75 g glycine in 100 ml, pH with 1 N HCl, make fresh.
    4. 1 M Tris- HCl (pH 8.5)
    2.4 g Tris in 20 ml

References

  1. Puig, O., Caspary, F., Rigaut, G., Rutz, B., Bouveret, E., Bragado-Nilsson, E., Wilm, M. and Seraphin, B. (2001). The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods 24(3): 218-229.

简介

进行抗体纯化以浓缩和富集抗原特异性抗体,并通过除去任何非特异性蛋白质在检测过程中降低背景信号。 亲和纯化利用分子之间的特异性结合相互作用,并且非常简单和有效。

材料和试剂

  1. PBS
  2. NaCl
  3. KCl
  4. Na HPO 4
  5. KH 2 PO 4
  6. 甘氨酸
  7. HCl
  8. Tris-HCl
  9. BSA
  10. Azide
  11. 亲和树脂
  12. Sepharose
  13. 10x PBS(请参阅配方)
  14. 1x PBS + 1 M NaCl(见配方)
  15. 0.1 M甘氨酸-HCl(pH 2.8)(参见配方)
  16. 1 M Tris-HCl(pH 8.5)(参见配方)

设备

  1. 离心机
  2. 亲和树脂
  3. 光谱仪

程序

  1. 将血清与亲和树脂(与琼脂糖结合的蛋白)混合。 如果使用全血清,用PBS稀释1:10。 温和搅拌孵育过夜。
  2. 将树脂倒入色谱柱中收集流出物。 这是1x预吸收的免疫血清。
  3. 用1×PBS(pH7.5)洗涤柱直到OD <280>为零
  4. 用PBS + 1M NaCl洗涤柱子以洗脱非特异性吸附的材料,直到OD <280>为零。
  5. 用PBS洗涤柱直到OD <280>为零。
  6. 用10体积的0.1M甘氨酸-HCl洗涤柱子以洗脱特异性结合的物质。 通过将等分试样(1/10的级分体积)的1M Tris-HCl(pH 8.5)放入级分收集管中来中和酸洗脱液。 这在用酸洗脱之前进行。 收集整个尾随峰 - 最高亲和力抗体释放最慢。
  7. 用PBS洗柱,直到OD <280> <0>为零
  8. 将抗体部分汇集并对PBS /叠氮化物透析过夜。 透析后,检查OD,加BSA至1%,等分并储存于-70℃

食谱

  1. 10x PBS(pH 7.5)
    40克NaCl
    1克KCl
    7.2g Na 2 HPO 4
    1.2g KH /> 500 ml
  2. 1x PBS + 1 M NaCl
    25 ml 10x PBS
    14.61g NaCl
    250 ml
  3. 0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.8)
    0.75g甘氨酸在100ml,用1N HCl pH调节,使新鲜。
    4. 1M Tris-HCl(pH 8.5)
    2.4克Tris在20ml中

参考文献

  1. Puig,O.,Caspary,F.,Rigaut,G.,Rutz,B.,Bouveret,E.,Bragado-Nilsson,E.,Wilm,M.and Seraphin,B。 串联亲和纯化(TAP)方法:蛋白复合物纯化的一般程序。 方法 24(3):218-229。
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引用:Pang, H. (2012). Antibody Affinity Purification. Bio-protocol Bio101: e208. DOI: 10.21769/BioProtoc.208;
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