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[Bio101] Cell Culture Mycoplasma Detection by PCR
[Bio101] 用PCR检测细胞培养支原体属   

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本文章节

Abstract

DNA was extracted from the supernatant of each sample. After PCR-amplification of mycoplasma DNA, detection was performed by gel electrophresis. The PCR primers were designed to cover the consensus sequences that can detect all types of mycoplasma species.

Materials and Reagents

  1. Ampli Taq Gold (Life Technologies, InvitrogenTM, catalog number: 4338856 )
  2. Sodium acetate
  3. Ethanol
  4. Phenol
  5. MgCl2
  6. PCR buffer
  7. Sodium acetate
  8. dNTPs
  9. Agarose gel
  10. TE-saturated phenol
  11. Ethidium bromide
  12. DDW
  13. Stock solution A (see Recipes)
  14. Master mixture A (see Recipes)

Equipment

  1. 1.5 ml Eppendorf tube
  2. Centrifuges
  3. Micropipette

Procedure

  1. Preparation of template DNA
    1. From cultured supernatant (in the case of cells)
      1. The sample aliquots (600 μl/sample) are obtained from the supernatant of the sample cells in the chamber. We use one 1.5 ml Eppendorf tube per sample.
      2. Add same amount of TE-saturated phenol (600 μl) to each eppendorf tube and mix vigously by vortex for several seconds.
      3. Centrifuge at 15,000 rpm for 5 min at room temperature (RT).
      4. Transfer the 400 μl supernatant to a new eppendorf tube and add 10 μl of 3 M sodium acetate.
      5. Mix well and spin down the aliquots.
      6. Add 2.5 times volume of absolute ethanol (1 ml), mix well, and keep at -80 °C for 15 min.
      7. Centrifuge at 15,000 rpm for 10 min at 4 °C.
      8. Discard the supernatant by micropipette and rinse with 80% ethanol.
      9. Centrifuge at 15,000 rpm for 10 min at 4 °C.
      10. Discard the supernatant by micropipette completely and air-dry.
      11. Dissolve in 40 μl DDW by vigorous vortexing and use this as the template DNA for PCR.

    2. From frozen ampule of sample cells
      1. Thaw the frozen ampule at RT.
      2. Open the ampule and take 600 μl of cell suspension to a 1.5 ml Eppendorf tube.
      3. Add same amount of TE-saturated phenol (600 μl) to each eppendorf tube and mix vigorously by vortex for several seconds. From this step, perform all the same procedures described in A. 2-11.
        Note: In this protocol the final 40 μl dissolved solution becomes quite viscous because of containing large amounts of genomic DNA from the sample cells. Therefore, vortex mixing is needed for a longer time.

  2. PCR
    Reaction mixture per sample (per one tube)
    50.0 μl
    DDW
    29.75 μl
    Stock solution A
    15.0 μl
    Template DNA
    5.0 μl
    Ampli Taq Gold(5 U/μl)
    0.25 μl
    Total
    1. Beforehand we make "Stock solution A” and "Master mixture A” for 10 tubes as recipes. Distribute 45 μl of "Master mixture A" to each tube.
    2. Add 5.0 μl of template DNA, mix well, and spin down.
    3. Perform PCR cycling by the thermal cycler machine as following schedule:
      95 °C
      9 min

      94 °C
      30 sec*

      55 °C
      2 min *
      *30 cycles repeated
      72 °C
      2 min *

      72 °C
      5 min

    4. Store the samples at 4 °C.

  3. Agarose gel electrophoresis
    1. 10 μl of PCR products are loaded onto 2% agarose gel.
    2. Stain the gel with ethidium bromide (0.1 μg/ml) for 10 min and take photograph under UV light.
      Note: If you know that the sample was highly contaminated by mycoplasma, you can use the supernatant from cultured sample cells directly for the PCR reaction mixture. In this case 3-5 μl of the supernatant will be applicable to the reaction mixture of PCR without all the above sample preparation procedures.

Recipes

  1. Stock solution A (15 μl for 1 sample)
    10x PCR buffer
    5 μl
    MgCl2 (25 mM)
    4 μl
    dNTPs (each 2.5 mM)
    4 μl
    Primer F1 (10 pmol/μl)
    1 μl
    Primer R1 (10 pmol/μl)
    1 μl
    Total
    15 μl
  2. Master mixture A (45 μl per tube, for 10 samples)
    DDW
    312.4 μl
    Stock solution A
    157.5 μl
    Ampli. Taq Gold
    2.6 μl
    Total
    472.5 μl

References

  1. Harasawa, R., Mizusawa, H., Nozawa, K., Nakagawa, T., Asada, K. and Kato, I. (1993). Detection and tentative identification of dominant mycoplasma species in cell cultures by restriction analysis of the 16S-23S rRNA intergenic spacer regions. Res Microbiol 144(6): 489-493.

简介

从每个样品的上清液中提取DNA。 在支原体DNA的PCR扩增后,通过凝胶电泳进行检测。 设计PCR引物以覆盖可以检测所有类型的支原体物种的共有序列。

材料和试剂

  1. Ampli Taq Gold(Life Technologies,Invitrogen TM ,目录号:4338856)
  2. 醋酸钠
  3. 乙醇
  4. 苯酚
  5. MgCl 2
  6. PCR缓冲区
  7. 醋酸钠
  8. dNTPs
  9. 琼脂糖凝胶
  10. TE饱和酚
  11. 溴化乙锭
  12. DDW
  13. 库存解决方案A(参见配方)
  14. 主混合物A(参见配方)

设备

  1. 1.5 ml Eppendorf管
  2. 离心机
  3. 微量移液器

程序

  1. 模板DNA的制备
    1. 从培养的上清液(在细胞的情况下)
      1. 例子 从样品的上清液中获得等分试样(600μl/样品)   细胞。 我们每个样品使用一个1.5 ml Eppendorf管
      2. 向每个eppendorf管中加入等量的TE-饱和的苯酚(600μl),并通过涡旋剧烈混合几秒钟。
      3. 在室温(RT)下以15,000rpm离心5分钟
      4. 将400μl上清液转移到新的eppendorf管中,加入10μl的3M乙酸钠
      5. 充分混合并旋转分装。
      6. 加入2.5倍体积的无水乙醇(1ml),充分混合,并在-80℃保持15分钟
      7. 在4℃下以15,000rpm离心10分钟。
      8. 通过微量移液管丢弃上清液,用80%乙醇冲洗。
      9. 在4℃下以15,000rpm离心10分钟。
      10. 用微量吸管完全弃去上清液并风干
      11. 通过剧烈涡旋溶解在40μlDDW中,并将其用作PCR的模板DNA。

    2. 从样品池的冷冻安瓿
      1. 在室温下解冻冷冻的安瓿。
      2. 打开安瓿,取600微升的细胞悬浮液到1.5毫升的Eppendorf管
      3. 向每个eppendorf中加入等量的TE-饱和的苯酚(600μl) 管并通过涡旋剧烈混合几秒钟。 从这一步, 执行A.2-11中描述的所有相同的过程。
        注意:在这里   方案最后40μl溶解的溶液变得相当粘稠 因为含有大量来自样品的基因组DNA 细胞。 因此,需要更长时间的涡流混合。

  2. PCR
    每个样品的反应混合物(每管)
    50.0μl
    DDW
    29.75微升
    库存解决方案A
    15.0微升
    模板DNA
    5.0微升
    Ampli Taq Gold(5 U /μl)
    0.25μl
    总计
    1. 预先我们制作"储备溶液A"和"主混合物A"10 管作为食谱。 向每个试管中分配45μl"主混合物A"
    2. 加入5.0μl模板DNA,混匀,旋转
    3. 按照以下时间表通过热循环仪机进行PCR循环:
      95°C
      9分钟

      94°C
      30秒*

      55°C
      2分钟*
      *重复30次循环
      72℃
      2分钟*

      72℃
      5分钟

    4. 将样品储存在4°C。

  3. 琼脂糖凝胶电泳
    1. 将10μlPCR产物加载到2%琼脂糖凝胶上
    2. 用溴化乙锭(0.1μg/ml)将凝胶染色10分钟,并在紫外光下拍照。
      注意:如果您知道样品受到高度污染 支原体,可以使用来自培养的样品细胞的上清液 直接用于PCR反应混合物。 在这种情况下3-5微升 上清液适用于PCR的反应混合物 所有上述样品制备程序。

食谱

  1. 储备溶液A(15μl,1个样品)
    10x PCR缓冲液
    5微升
    MgCl 2(25mM) 4微升
    dNTP(各2.5mM) 4微升
    引物F1(10pmol/μl)
    1微升
    引物R1(10pmol/μl)
    1微升
    总计
    15微升
  2. 主混合物A(每管45μl,10个样品)
    DDW
    312.4μl
    库存解决方案A
    157.5微升
    Ampli。 Taq Gold
    2.6μl
    总计
    472.5微升

参考文献

  1. Harasawa,R.,Mizusawa,H.,Nozawa,K.,Nakagawa,T.,Asada,K.and Kato,I。(1993)。 通过16S-23S rRNA基因间隔的限制性分析检测和暂时鉴定细胞培养物中的优势支原体物种 spacer region。 Res Microbiol 144(6):489-493。
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Copyright: © 2017 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Pang, H. (2012). Cell Culture Mycoplasma Detection by PCR. Bio-protocol Bio101: e207. DOI: 10.21769/BioProtoc.207;
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