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[Bio101] Make Human Umbilical Vein Endothelial Cells from Cords
[Bio101] 人脐静脉内皮细胞的制备   

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本文章节

Abstract

Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) can be isolated from normal human umbilical veins, and are responsive to cytokine stimulation by expressing cell adhesion molecules. These cell systems are commonly used for physiological and pharmacological investigations, such as macromolecule transport, blood coagulation, and angiogenesis. This protocol describes the generation of HUVECs.

Materials and Reagents

  1. Collagenase I (Life Technologies, InvitrogenTM, catalog number: 17100-017 )
  2. Endothelial cell growth supplement (ECGS) (Sigma-Aldrich, catalog number: E2759 )
  3. M199 medium
  4. Fetal calf serum (FCS)
  5. Phosphate buffered saline (PBS)
  6. Pen/Strep
  7. Sodium pyruvate
  8. Antibiotic
  9. Ethanol
  10. Collagenase solution
  11. Culture medium (see Recipes)

Equipment

  1. Needle
  2. Clamps
  3. Syringes
  4. Syringe filter
  5. Parafilm
  6. Heparin
  7. Culture hood
  8. Sterilized beaker
  9. 50 ml tube

Procedure

  1. Wash all tools, glassware and tray in detergent and then put them in ethanol for 20 min under UV in the culture hood.
  2. Prewarm PBS and collagenase I (100 ml of PBS for one cord) at 37 °C.
  3. Dilute 1 ml of collagenase (20 mg/ml) into 20 ml of warm PBS, spin at 1,000 x g for 5 min.
  4. Discard the pellet and filter the supernatant using syringe filter under sterile conditions.
  5. Take the cord from the bottle, cut ~1 cm from each site (because the ends may be contaminated). Check if the cord is damaged (holes etc), if so discard it.
  6. There are three blood vessels in the cord, find the biggest one.
  7. Cut the very end of the needle, insert it in the biggest blood vessel hole, fix the needle with the clamp.
  8. Screw on the syringe, wash the cord with warm PBS until no blood is leaking from the cord.
  9. Put the second clamp at the other end of the cord.
  10. Pump 20 ml of collagenase solution into cord, be careful not to blow up the cord.
  11. Incubate at 37 °C for 10 min in a sterilized beaker, seal with parafilm.
  12. Cut the lower end open. Put all collagenase I to a 50 ml tube, spin at 1,000 x g for 5 min.
  13. Remove supernatnat, resuspend pellet in 3 ml complete M199 medium.
  14. Plate on to a 3 cm tissue culture dish.

Recipes

  1. Culture medium
    20% (v/v) FCS
    10 μg/ml ECGS
    100 U/ml antibiotic
    Sodium pyruvate
    20 U/ml heparin
    All dissolved in M199 medium

References

  1. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G. and Minick, C. R. (1973). Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest 52(11): 2745-2756.
  2. Ratcliffe, K. E., Tao, Q., Yavuz, B., Stoletov, K. V., Spring, S. C. and Terman, B. I. (2002). Sck is expressed in endothelial cells and participates in vascular endothelial growth factor-induced signaling. Oncogene 21(41): 6307-6316.

简介

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)可以从正常人脐静脉中分离,并且通过表达细胞粘附分子对细胞因子刺激响应。 这些细胞系统通常用于生理学和药理学研究,例如大分子运输,血液凝固和血管生成。 该协议描述了HUVEC的产生。

材料和试剂

  1. 胶原酶I(Life Technologies,Invitrogen TM ,目录号:17100-017)
  2. 内皮细胞生长补充剂(ECGS)(Sigma-Aldrich,目录号:E2759)
  3. M199介质
  4. 胎牛血清(FCS)
  5. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
  6. Pen/Strep
  7. 丙酮酸钠
  8. 抗生素
  9. 乙醇
  10. 胶原酶溶液
  11. 培养基(见配方)

设备


  1. 夹具
  2. 注射器
  3. 注射器过滤器
  4. parafilm
  5. 肝素
  6. 文化宫
  7. 灭菌烧杯
  8. 50ml管

程序

  1. 在洗涤剂中清洗所有工具,玻璃器皿和托盘,然后在培养罩中在UV下将其放入乙醇中20分钟。
  2. 在37℃下预温热的PBS和胶原酶I(100ml的PBS用于一条线)
  3. 稀释1毫升胶原酶(20毫克/毫升)到20毫升温暖的PBS,1000×g旋转5分钟。
  4. 弃去沉淀,并在无菌条件下使用注射器过滤器过滤上清液
  5. 从瓶子取出电线,从每个位置切割〜1厘米(因为端部可能被污染)。 检查电线是否损坏(孔等),如果是这样丢弃
  6. 线中有三条血管,找到最大的一条。
  7. 切开针头的最末端,将其插入最大的血管孔中,用夹子固定针头
  8. 拧上注射器,用温热的PBS清洗线,直到血液从线中漏出
  9. 将第二个夹子放在电线的另一端。
  10. 泵20毫升胶原酶溶液进入电源线,小心不要炸开电源线。
  11. 在灭菌的烧杯中37℃孵育10分钟,用封口膜密封
  12. 切开下端开口。 将所有胶原酶I放入50ml管中,以1,000×g旋转5分钟。
  13. 取出上清液,将沉淀重悬于3ml完全M199培养基中。
  14. 平板到3cm组织培养皿。

食谱

  1. 培养基
    20%(v/v)FCS
    10μg/ml ECGS
    100U/ml抗生素
    丙酮酸钠
    20 U/ml肝素
    全部溶于M199培养基中

参考文献

  1. Jaffe,E.A.,Nachman,R.L.,Becker,C.G。和Minick,C.R。(1973)。 源自脐静脉的人内皮细胞的培养。 通过形态学和免疫学标准鉴定。 52(11):2745-2756。
  2. Ratcliffe,K.E.,Tao,Q.,Yavuz,B.,Stoletov,K.V.,Spring,S.C.and Terman,B.I。(2002)。 Sck在内皮细胞中表达,并参与血管内皮生长因子诱导的信号传导。 Oncogene 21(41):6307-6316
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Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Pang, H. (2012). Make Human Umbilical Vein Endothelial Cells from Cords. Bio-protocol Bio101: e204. DOI: 10.21769/BioProtoc.204;
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