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[Bio101] Protein Extraction from Mice Xenograft Tumor
[Bio101] 小鼠移植瘤蛋白提取

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本文章节

Abstract

Proteins from frozen tissue such as xenograft tumor need to be extracted efficiently without being degraded to make the best use of a limited resource and to ensure that an accurate representation of proteins in selected tumor tissue can be obtained. This protocol describes how to extract proteins from xenograft tumors in mice.

Materials and Reagents

  1. NaCl
  2. Tris
  3. EDTA
  4. NP-40
  5. EGTA
  6. NaF
  7. Beta-glycerophosphate
  8. Sodium pyrophosphate
  9. Sodium vanadate
  10. Isoflurane
  11. PMSF
  12. Laemmli buffer
  13. Liquid nitrogen
  14. Phosphatase inhibitor 1/2 (Sigma-Aldrich, catalog number: P2850 , P5726 )
  15. BCA kit (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 23227 )
  16. Lysis buffer(see Recipes)

Equipment

  1. Centrifuges
  2. Sonicator
  3. Western blotting equipment

Procedure

  1. Anesthetize the mice using isoflurane.
  2. Rapidly remove the tumor from live mice.
  3. Flash freeze the xenograft tumor in liquid nitrogen, then store at -80 °C or proceed to direct preparation of the samples.
  4. Break frozen tissue (present in liquid nitrogen) into several small pieces, and weigh one or two pieces.
  5. In dry ice, smash tissue in to smaller pieces, then add lysis buffer 2.5 μl/mg. Homogenize on ice.
  6. Sonicate for 5 sec at low setting on ice. Incubate on ice for 30 min.
  7. Spin at 13,000 rpm for 15 min at 4 °C.
  8. Transfer supernatant to a new tube.
  9. Dilute samples and perform protein assay using Pierce’s BCA kit.
  10. Adjust the concentration to an identical level.
  11. Add 5x Laemmli buffer and boil for western blot.

Recipes

  1. Lysis buffer
    150 mM NaCl
    10 mM Tris
    1 mM EDTA
    1% NP-40
    1 mM EGTA
    50 mM NaF
    40 mM beta-glycerophosphate
    10 mM sodium pyrophosphate
    1 mM sodium vanadate
    8 mM PMSF
    phosphatase inhibitor 1/2

References

  1. Dignam, J. D. (1990). Preparation of extracts from higher eukaryotes. Methods Enzymol 182: 194-203.
  2. Pang, H., Flinn, R., Patsialou, A., Wyckoff, J., Roussos, E. T., Wu, H., Pozzuto, M., Goswami, S., Condeelis, J. S., Bresnick, A. R., Segall, J. E. and Backer, J. M. (2009). Differential enhancement of breast cancer cell motility and metastasis by helical and kinase domain mutations of class IA phosphoinositide 3-kinase. Cancer Res 69(23): 8868-8876.

简介

腺病毒是有效的基因递送系统。 用于纯化腺病毒载体的标准方法基于使用氯化铯(CsCl)密度梯度与超速离心的组合。 该方法适合于小规模纯化,并且比柱层析或商业纯化试剂盒更便宜。...

材料和试剂

  1. NaCl
  2. Tris
  3. EDTA
  4. NP-40
  5. EGTA
  6. NaF
  7. β-甘油磷酸酯
  8. 焦磷酸钠
  9. 钒酸钠
  10. 异氟烷
  11. PMSF
  12. Laemmli缓冲区
  13. 液氮
  14. 磷酸酶抑制剂1/2(Sigma-Aldrich,目录号:P2850,P5726)
  15. BCA试剂盒(Thermo Fisher Scientific,目录号:23227)
  16. 裂解缓冲液(见配方)

设备

  1. 离心机
  2. 超声波仪
  3. Western印迹设备

程序

  1. 麻醉小鼠使用异氟烷。
  2. 快速从活的小鼠中清除肿瘤。
  3. 在液氮中快速冷冻异种移植肿瘤,然后储存在-80℃或进行样品的直接制备。
  4. 将冷冻的组织(存在于液氮中)分成几块小块,称重一或两块
  5. 在干冰中,将组织粉碎成较小的片,然后加入裂解缓冲液2.5μl/mg。 冰上均质。
  6. 在低温下在冰上超声处理5秒。 在冰上孵育30分钟。
  7. 在4℃下以13,000rpm旋转15分钟。
  8. 将上清液转移到新试管中
  9. 稀释样品,并使用Pierce的BCA试剂盒进行蛋白质测定
  10. 将浓度调整到相同水平。
  11. 加入5x Laemmli缓冲液并煮沸以进行Western印迹

食谱

  1. 裂解缓冲液
    150mM NaCl 10 mM Tris
    1mM EDTA
    1%NP-40
    1 mM EGTA
    50mM NaF 40mMβ-甘油磷酸盐 10mM焦磷酸钠 1 mM钒酸钠 8 mM PMSF
    磷酸酶抑制剂1/2

参考文献

  1. Dignam,J.D。(1990)。 从高等真核生物提取物的制备 方法Enzymol 182 :194-203。
  2. Pang,H.,Flinn,R.,Patsialou,A.,Wyckoff,J.,Roussos,ET,Wu,H.,Pozzuto,M.,Goswami,S.,Condeelis,JS,Bresnick,AR,Segall,JE 和Backer,JM(2009)。 通过IA类磷酸肌醇3-激酶的螺旋和激酶结构域突变的乳腺癌细胞运动和转移的差别增强。 em> Cancer Res 69(23):8868-8876。
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引用:Pang, H. (2012). Protein Extraction from Mice Xenograft Tumor. Bio-protocol Bio101: e202. DOI: 10.21769/BioProtoc.202;
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