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[Bio101] Zebrafish Embryo DNA Preparation
[Bio101] 斑马鱼胚胎DNA的制备   

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本文章节

Abstract

This protocol explains how to extract DNA from a single zebrafish embryo.

Materials and Reagents

  1. Proteinase K (Roche Diagnostics, catalog number: 03115836001 )
  2. 1 M Tris (pH 8.3)
  3. NaCl
  4. KCl
  5. CaCl2•2H2O
  6. MgSO4•7H2O
  7. Sterile water
  8. 10%Tween 20 (EMD Biosciences, catalog number: 655207 )
  9. 10% NP40 (Merck KGaA, catalog number: 492018 )
  10. Embryo lysis buffer (see Recipes)
  11. 1x PCR buffer (see Recipes)
  12. E3 (see Recipes)

Equipment

  1. PCR Thermal cycler
  2. Centrifuges
  3. Incubator
  4. 96-well plate

Procedure

  1. Freezing single live embryos
    1. Wash dechorionated embryos 3x with E3.
    2. Place a single embryo into a well of a 96-well plate and remove all excess buffer.
      (Store dry at -20 °C if needed).

  2. DNA preparation:
  1. Add 50 μl lysis buffer to single (live or in situ'd) embryos.
  2. Incubate at 98 °C for 10 min to lyse cells. Spin down.
  3. Add 5 μl Proteinase K (10 mg/ml stock) to single embryos.
  4. Incubate at 55 °C for at least 2 h (longer the incubation, cleaner the DNA).
  5. Incubate at 98 °C to heat kill Proteinase K.
  6. Vortex thoroughly and spin down debris.
  7. Use 2 μl of single embryo DNA per PCR reaction.

Recipes

  1. 1x PCR buffer
    For 50 ml
    10 mM Tris-HCl (500 μl of 1 M Tris) (pH 8.3)
    50 mM KCl (2.5 ml of 1 M KCl)
    47 ml sterile water
    (Can be stored at RT for severalmonths)
  2. Embryo lysis buffer (1x PCR buffer with tween 20 and NP40)
    For 10 ml of lysis buffer
    9.4 ml 1x PCR buffer
    300 μl NP40 (10% stock) ***Make fresh
    300 μl tween 20 (10% stock) each time***
  3. E3
    60x E3 stock (2 L)
    NaCl                 34.4 g  
    KCl                   1.52 g
    CaCl2.2H2O      5.8 g
    MgSO4.7H2O    9.8 g
    Add distilled water up to 2,000 ml.
    Store at RT.
    To dilute to 1x for rearing zebrafish, use 160 ml of stock and fill to 10 L with ddH2O

Acknowledgments

This protocol was developed in the Michael Granato Lab at University of Pennsylvania, Philadelphia, USA, and this work was supported by NIH grant R01HD037975.

简介

这个协议解释如何从单个斑马鱼胚胎提取DNA。

材料和试剂

  1. 蛋白酶K(Roche Diagnostics,目录号:03115836001)
  2. 1 M Tris(pH 8.3)
  3. NaCl
  4. KCl
  5. CaCl 2 2·2H 2 O
  6. MgSO 4·7H 2 O
  7. 无菌水
  8. 10%Tween 20(EMD Biosciences,目录号:655207)
  9. 10%NP40(Merck KGaA,目录号:492018)
  10. 胚胎裂解缓冲液(见配方)
  11. 1x PCR缓冲液(见配方)
  12. E3(见配方)

设备

  1. PCR热循环仪
  2. 离心机
  3. 孵化器
  4. 96孔板

程序

  1. 冻结单活胚胎
    1. 洗涤dechorionated胚胎3x与E3。
    2. 将单个胚胎放入96孔板的孔中,并除去所有过量的缓冲液 (如果需要,在-20℃下干燥)
  2. DNA制备:
  1. 添加50μl裂解缓冲液到单个(活的或原位'd)胚胎。
  2. 在98℃孵育10分钟以裂解细胞。 向下旋转。
  3. 加入5微升蛋白酶K(10毫克/毫升股票)单胚胎。
  4. 在55°C孵育至少2小时(孵化更长,更清洁DNA)。
  5. 在98℃孵育以热杀蛋白酶K.
  6. 彻底涡旋和旋转碎片。
  7. 每个PCR反应使用2μl单个胚胎DNA

食谱

  1. 1×PCR缓冲液
    对于ml
    10mM Tris-HCl(500μl1M Tris)(pH8.3) 50mM KCl(2.5ml 1M KCl) 47毫升无菌水
    (可以在RT存储几个月)
  2. 胚胎裂解缓冲液(具有吐温20和NP40的1x PCR缓冲液)
    对于10ml裂解缓冲液
    9.4 ml 1×PCR缓冲液
    300μlNP40(10%股票)***新鲜
    每次300μl吐温20(10%储备液)***
  3. E3
    60x E3库存(2升)
    NaCl                  34.4克
    KCl                    1.52克
    CaCl 2 .2H 2 O      5.8克
    MgSO 4 .7H 2 O 2。    9.8克
    加入蒸馏水至2,000ml。
    存储在RT。
    为了稀释到1x,以饲养斑马鱼,使用160毫升的股票,填充到10升与ddH 2 O

致谢

该协议是在美国宾夕法尼亚大学的Michael Granato实验室开发的,这项工作由NIH授权R01HD037975支持。

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Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Jing, L. (2012). Zebrafish Embryo DNA Preparation. Bio-protocol Bio101: e184. DOI: 10.21769/BioProtoc.184;
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