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[Bio101] Flourescent Immunostaining Protocol for a-Bungorotoxin (AChRs) in Zebrafish
[Bio101] 斑马鱼Bungorotoxin(AChRs)免疫荧光染色的方法   

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本文章节

Abstract

Zebrafish embryo is convenient for studying neuromuscular system due to its transparency. This protocol is a rapid method to visualize the AChR clusters on the postsynaptic muscle membrane.

Materials and Reagents

  1. Paraformaldehyde (USB Corporation, catalog number: 19943 )
  2. Phosphate buffered saline (PBS)
  3. DMSO
  4. Triton-100
  5. Na2HPO4
  6. NaH2PO4
  7. Collagenase (Sigma-Aldrich, catalog number: C-9891 )
  8. α-Bungorotoxin conjugated to Alexa 594 (Life Technologies, Invitrogen™, catalog number: B-13423)
  9. Vectashied (Vector Lab, catalog number: H-1400 )
  10. Primary antibody
  11. Secondary antibody
  12. Incubation Buffer (IB) (see Recipes)
  13. 0.1 M phosphate buffer(7.4) (see Recipes)

Equipment

  1. Rotator (Storvall Life Science, the Belly Dancer)
  2. Fluorescence microscope
  3. Transfer pipette

Procedure

  1. Dechorinate embryos and remove all E3 buffer.
  2. Fix the embryos using 4% paraformaldehyde in PBS+1% DMSO at RT for 4 h or O/N at 4 °C.
  3. Remove paraformaldehyde with a transfer pipette. Wash 3 x 10 min with PBS (don’t use PBST).
  4. Add 0.1% (1 mg/ml in 1x PBS) collagenase and incubate at RT. Treatment times vary according to age: up to 24 h=6 min; 24 to 36 h=9 min; 48 h=45 min; 3 d=75 min; 4 d=?; 5 d=Don’t collagenase treat, peel larvae using sharp forceps instead.
  5. Remove collagenase solution. Wash 3 x 5 min in PBS.
  6. Incubate 30 min in 10 μg/ml a-Bungorotoxin conjugated to Alexa 594 (molecular probe B-13423) in IB at RT.
  7. Wash 3 x 5 min in IB.
  8. If doing double staining, incubate the embryos in primary antibody diluted in IB O/N at 4 °C. Otherwise go to step 11.
  9. Remove primary antibody, wash 6 x 10min in IB.
  10. Remove IB, replace with secondary antibody diluted in IB.
  11. Remove secondary antibody, wash 6 x 10 min in IB.
  12. Remove IB, replace with 1 drop Vectashield. Let embryos settle to bottom of tube overnight. Store embryos at 4 °C.
  13. Mount embryos in Vectashied.

Recipes

  1. Incubation Buffer (IB) (400 ml)
    BSA                                        0.8 g
    10%Triton-100                        20 ml
    0.1M phosphate buffer (7.4)     380 ml
    Store at 4 °C
  2. 0.1 M phosphate buffer(7.4)    400 ml
    0.2 M Na2HPO           162 ml
    0.2 M NaH2PO           38 ml
    H2O                           200 ml

Acknowledgments

This protocol was developed in the Michael Granato Lab at University of Pennsylvania, Philadelphia, USA, and this work was supported by NIH grant R01HD037975.

简介

斑马鱼胚胎由于其透明性方便研究神经肌肉系统。 这个协议是一种快速的方法来可视化突触后肌肉膜上的AChR簇

材料和试剂

  1. 多聚甲醛(USB Corporation,目录号:19943)
  2. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
  3. DMSO
  4. Triton-100
  5. Na 2 HPO 4
  6. NaH 2 PO 4 4
  7. 胶原酶(Sigma-Aldrich,目录号:C-9891)
  8. 与Alexa 594缀合的α-Bungorotoxin(Life Technologies,Invitrogen TM,目录号:B-13423)
  9. Vectashied(Vector Lab,目录号:H-1400)
  10. 一抗
  11. 二抗
  12. 孵育缓冲液(IB)(参见配方)
  13. 0.1 M磷酸盐缓冲液(7.4)(见配方)

设备

  1. 旋转器(Storvall Life Science,肚皮舞)
  2. 荧光显微镜
  3. 转移移液器

程序

  1. Dechorinate胚胎和删除所有E3缓冲区。
  2. 使用4%多聚甲醛在PBS + 1%DMSO中在室温固定胚胎4小时或O/N在4℃。
  3. 用移液管移除多聚甲醛。 用PBS洗涤3×10分钟(不使用PBST)。
  4. 加入0.1%(1mg/ml,在1×PBS中)胶原酶,并在室温下孵育。 治疗时间根据年龄而变化:高达24小时= 6分钟; 24至36h = 9min; 48小时= 45分钟; 3 d = 75分钟; 4 d =? 5 d =不用胶原酶处理,用锋利的镊子取下幼虫。
  5. 去除胶原酶溶液。 在PBS中洗涤3×5分钟。
  6. 孵育30分钟在10μg/mlα-偶联的Alexa 594(分子探针B-13423)在IB在室温下的Bungorotoxin。
  7. 在IB中洗涤3×5分钟。
  8. 如果进行双染色,孵育胚胎在第一抗体稀释在1B O/N在4℃。 否则转到步骤11。
  9. 取出一抗,在IB中洗6×10分钟。
  10. 取出IB,更换为在IB中稀释的二抗。
  11. 移除二级抗体,在IB中洗涤6×10分钟。
  12. 取出IB,更换1滴Vectashield。 让胚胎沉降到管底部过夜。 存储胚胎在4°C。
  13. 在Vectashied中安装胚胎。

食谱

  1. 孵育缓冲液(IB)(400ml) BSA                                         0.8 g
    10%Triton-100                       20ml
    0.1M磷酸盐缓冲液(7.4)    380 ml
    存储在4°C
  2. 0.1 M磷酸盐缓冲液(7.4)    400 ml
    0.2 M Na 2 HPO <4>           162 ml
    0.2 M NaH 2 PO 4 sub 4           38 ml
    H 2 O                          200 ml

致谢

该协议是在美国宾夕法尼亚大学的Michael Granato实验室开发的,这项工作由NIH授权R01HD037975支持。

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Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Jing, L. (2012). Flourescent Immunostaining Protocol for a-Bungorotoxin (AChRs) in Zebrafish. Bio-protocol Bio101: e183. DOI: 10.21769/BioProtoc.183;
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