搜索

[Bio101] Genotyping for Single Zebrafish (Fin Clip) or Zebrafish Embryo
[Bio101] 单成年斑马鱼(Fin Clip)或幼期斑马鱼的基因分型   

下载 PDF 引用 收藏 提问与回复 分享您的反馈 Cited by

本文章节

Abstract

Zebrafish is increasingly used a genetic model organism in biomedical studies. This protocol provides a detailed procedure about the identification of the genotype of an adult zebrafish or a zebrafish embryo.

Materials and Reagents

  1. Tricane (Sigma-Aldrich, catalog number: 886-86-2 )
  2. dNTPS (QIAGEN, catalog number: 201900 )
  3. Proteinase K (Roche Diagnostics, catalog number: 03115836001 )
  4. MEOH
  5. DNA polymerase 
  6. MgCl2
  7. Tris 
  8. KCl
  9. MgCl2
  10. Gelatine
  11. BSA
  12. NP40
  13. Tween 20
  14. PCR lysis buffer (see Recipes)
  15. RAPD+ (see Recipes)
  16. 1x RAPD buffer (see Recipes)
  17. 2x RAPD+ buffer (see Recipes)
  18. Tricane solution (see Recipes)

Equipment

  1. Standard tabletop centrifuges
  2. Incubator (55 °C and 65 °C)
  3. PCR thermal cycler
  4. 96-well PCR plate
  5. Razors
  6. Plastic plates
  7. Plastic beaker
  8. Forceps
  9. Spoon

Procedure

  1. Fin clip:
    1. Bring clean plastic plates, razors, Tricane, a plastic beaker, forceps and a spoon to fish room.
    2. Prepare a 96-well plate, with 100-200 μl of MEOH in each well. 
    3. Add 20 ml Tricane to the beaker and add clean water to dilute the tricane (1:15 dilution).
    4. Put the fish into the tricane solution and let the fish sleep. Move the fish to a clean plate and cut a small piece of the tail fin.
    5. Quickly put the fish back to the single box and put the tail into one well of the PCR plate with MEOH in it.
    6. Label both the single box and the well.
    7. Make sure the tail is in the MEOH (the fish can be kept in single boxes for up to 5 days).
      Note: A single embryo can be kept in MEOH directly.

  2. Genomic DNA extraction:
    1. Remove as much MEOH as possible.
    2. Incubate at 55 °C for 5 min to evaporate all MEOH.
    3. Add 100 μl lysis buffer per well (200 μl lysis buffer for 72 hpf embryo).
    4. Incubate at 55 °C O/N and heat inactivate at 95 °C for 10 min.
    5. Centrifuge at 4 °C at 1,000 rpm for 2-10 min.
    6. Store DNA at -20 °C or for long time at -80 °C.

  3. PCR after genomic DNA extraction
    1. PCR reaction set up
      X μl       RAPD+ (make up to 20 μl)
      1-2 μl    DNA
      1 μl       Forward primer (20 μM)
      1 μl       Reverse primer (20 μM)
      1 μl       Taq Polymerase
      For multiple PCRs, make a master mix (keep mixture and the plate on ice). 
    2. PCR program
      94                       1 min
      94                        30 sec
      54                        2 min
      73                        1 min
                                  go to ii. 5x
      94                        30 sec
      55                        30 sec
      73                        1 min
                                  go to vi. 35x
      4                           hold
                                   end
      Use H2O as the negative control to make sure the buffer is clean.
    3. Run 2-5 μl PCR reaction to check the DNA yield.
    4. Digest DNA fragment
      Cut DNA in 30 μl reaction:
      DNA                    2-5 μl (dependent on the yield)
      Enzyme*             0.5 μl
      10x buffer           3 μl
      Cut for about 10 h.
      * Enzyme can be selected by the dCAPs program online:
      http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html
      May get incomplete digestion.
    5. Run gel and examine the PCR results.

Recipes

  1. Tricane solution
    400 mg Tricane powder in 97.9 ml ddH2O and use 2.1 ml Tris (pH 9) to adjust pH to 7.
  2. 1x RAPD buffer
    1.55 ml    150 mM MgCl2
    1.5 ml      1 M Tris (pH 8.3)
    7.5 ml      1 M KCl
    1.5 ml      0.1% Gelatine (heat gelatin to dissolve completely)
    12.05 ml
    Add 88 ml H2O and autoclave at 121 °C for 20 min. Store at 4 °C.
  3. RAPD+ (100 ml)
    30 μl        dATP
    30 μl       dCTP
    30 μl       dGTP
    30 μl       dTTP (each 100 mM)
    150 μl     BSA (20 mg/ml)
    Aliquot and store at -80 °C.
  4. 2x RAPD+ might work better for PCR than 1x RAPD+
    100 ml
    3.1 ml           150 mM MgCl2
    3 ml              1 M Tris (pH 8.3)
    15 ml            1 M KCl
    3 ml              0.1% Gelatine
    Add 75.9 ml H2O and autoclave at 121 °C for 20 min and add 2x nucleotides.
  5. PCR lysis buffer
    1x RAPD buffer
     0.3 %            Tween 20
    0.3%              NP40
    100 μg/ml      Proteinase K
    Store at -20 °C.

Acknowledgments

This protocol was developed in the Michael Granato Lab at University of Pennsylvania, Philadelphia, USA, and this work was supported by NIH grant R01HD037975.

简介

斑马鱼越来越多地用于生物医学研究中的遗传模型生物。 该协议提供了关于成年斑马鱼或斑马鱼胚胎的基因型鉴定的详细程序。

材料和试剂

  1. Tricane(Sigma-Aldrich,目录号:886-86-2)
  2. dNTPS(QIAGEN,目录号:201900)
  3. 蛋白酶K(Roche Diagnostics,目录号:03115836001)
  4. MEOH
  5. DNA聚合酶
  6. MgCl 2
  7. Tris 
  8. KCl
  9. MgCl 2
  10. 明胶
  11. BSA
  12. NP40
  13. 吐温20
  14. PCR裂解缓冲液(参见Recipes)
  15. RAPD + (请参阅配方)
  16. 1x RAPD缓冲区(参见配方)
  17. 2x RAPD + 缓冲区(见Recipes)
  18. Tricane溶液(参见配方)

设备

  1. 标准台式离心机
  2. 孵育器(55℃和65℃)
  3. PCR热循环仪
  4. 96孔PCR板
  5. 剃刀
  6. 塑料板
  7. 塑料烧杯
  8. 镊子

程序

  1. 鳍夹:
    1. 带干净的塑料板,剃刀,Tricane,塑料烧杯,镊子和勺子到鱼室。
    2. 准备96孔板,每个孔中加入100-200μl的MEOH。
    3. 加入20ml Tricane到烧杯中,加入干净的水稀释三氯乙烷(1:15稀释)。
    4. 把鱼放入tricane溶液,让鱼睡觉。 将鱼移动到一个干净的板,并切割一小块的尾翼。
    5. 快速将鱼放回单个盒子,并将尾部放入PCR板的一个孔中,其中含有MEOH。
    6. 标记单个框和井。
    7. 确保尾巴在MEOH(鱼可以保存在单个箱子里长达5天)。
      注意:一个胚胎可以直接保存在MEOH中。

  2. 基因组DNA提取:
    1. 尽可能多地除去MEOH。
    2. 在55℃孵育5分钟以蒸发所有的MEOH。
    3. 每孔加入100μl裂解缓冲液(200μl裂解缓冲液,用于72 hpf胚胎)。
    4. 在55℃O/N孵育并在95℃加热灭活10分钟。
    5. 4℃,1,000rpm离心2-10分钟。
    6. 将DNA保存在-20°C或长时间在-80°C
  3. 基因组DNA提取后的PCR
    1. PCR反应设置
      Xμl       RAPD +(达20μl)
      1-2微升    DNA
      1微升      正向引物(20μM)
      1微升      反向引物(20μM)
      1微升       Taq聚合酶
      对于多重PCR,制作主混合物(保持混合物和板在冰上)。
    2. PCR程序
      94                       1分钟
      94                        30秒
      54                       2分钟
      73                        1分钟
                                 去ii。 5x
      94                        30秒
      55                       30秒
      73                        1分钟
                                 去vi。 35x
      4                       保持
                                  结束
      使用H 2 O作为阴性对照,以确保缓冲区是干净的。
    3. 运行2-5μlPCR反应检查DNA产量。
    4. 摘要DNA片段
      在30μl反应中切割DNA:
      DNA                     2-5μl(取决于产量)
      酶*              0.5μl
      10x缓冲区            3微升
      切大约10小时。
      *酶可以通过dCAPs程序在线选择:
      http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html
      可能会消化不完全。
    5. 运行凝胶并检查PCR结果

食谱

  1. Tricane溶液
    400mg Tricane粉末在97.9ml ddH 2 O中,并使用2.1ml Tris(pH 9)调节pH至7.
  2. 1x RAPD缓冲区
    1.55 ml    150mM MgCl 2/v/v 1.5 ml      1 M Tris(pH 8.3)
    7.5 ml      1 M KCl
    1.5 ml      0.1%明胶(热凝胶完全溶解)
    12.05 ml
    加入88ml H 2 O并在121℃下高压灭菌20分钟。储存于4°C。
  3. RAPD + (100ml)
    30μl        dATP
    30μl       dCTP
    30μl       dGTP
    30μl       dTTP(各为100mM) 150μl     BSA(20mg/ml) 等分并储存于-80℃
  4. 2x RAPD + 可能比1x RAPD + 更好地工作
    100 ml
    3.1 ml            150mM MgCl 2/v/v 3毫升               1 M Tris(pH 8.3)
    15毫升             1 M KCl
    3毫升               0.1%明胶
    加入75.9ml H 2 O并在121℃高压灭菌20分钟并加入2×核苷酸。
  5. PCR裂解缓冲液
    1x RAPD缓冲区
      0.3%             吐温20
    0.3%               NP40
    100μg/ml      蛋白酶K
    储存于-20°C。

致谢

该协议是在美国宾夕法尼亚大学的Michael Granato实验室开发的,这项工作由NIH授权R01HD037975支持。

  • English
  • 中文翻译
免责声明 × 为了向广大用户提供经翻译的内容,www.bio-protocol.org 采用人工翻译与计算机翻译结合的技术翻译了本文章。基于计算机的翻译质量再高,也不及 100% 的人工翻译的质量。为此,我们始终建议用户参考原始英文版本。 Bio-protocol., LLC对翻译版本的准确性不承担任何责任。
Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Jing, L. (2012). Genotyping for Single Zebrafish (Fin Clip) or Zebrafish Embryo. Bio-protocol Bio101: e182. DOI: 10.21769/BioProtoc.182;
提问与回复

(提问前,请先登录)bio-protocol作为媒介平台,会将您的问题转发给作者,并将作者的回复发送至您的邮箱(在bio-protocol注册时所用的邮箱)。为了作者与用户间沟通流畅(作者能准确理解您所遇到的问题并给与正确的建议),我们鼓励用户用图片或者视频的形式来说明遇到的问题。由于本平台用Youtube储存、播放视频,作者需要google 账户来上传视频。

当遇到任务问题时,强烈推荐您提交相关数据(如截屏或视频)。由于Bio-protocol使用Youtube存储、播放视频,如需上传视频,您可能需要一个谷歌账号。