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[Bio101] Genotyping Transgenic Zebrafish Using Genomic DNA Extracted from Clutch of Embryos (Originally by J. Lefebvre)
[Bio101] 利用从胚胎中提取的基因组DNA对转基因斑马鱼进行基因分型   

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本文章节

Abstract

Transgenic zebrafish are very useful genetic tools to study various biological processes. Identification the right transgene founder and the subsequent transgenic animals are always tedious and time consuming. This protocol provides a relatively rapid and easy method to identify the founder parent using a clutch of embryos.

Materials and Reagents

  1. Zebrafish embryos
  2. MeOH
  3. Phenol
  4. Chloroform
  5. Isoamyl alcohol (IAA)
  6. NaCl
  7. KCl
  8. MgCl2
  9. EtOH
  10. TE
  11. Tween 20
  12. NaOAC
  13. Gelatine
  14. NP40
  15. Proteinase K
  16. ddH2O
  17. Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1)
  18. Primers (custom ordered from IDT)
  19. 1x RAPD buffer (see Recipes)
  20. RAPD+ (see Recipes)
  21. PCR lysis buffer (see Recipes)

Equipment

  1. PCR thermal cycler
  2. Incubator
  3. Glass pipette
  4. Remove MeOH and dry embryos in 55 °C incubator.

Procedure

  1. Collect embryos
    Groups of 25-40, 1 transgenic embryo in clutch of 40 embryos should be detected, fix in MeOH, store at -20 °C.
    1. Remove MeOH and dry embryos in 55 °C incubator.
    2. Add 10 μl/embryo of lysis buffer (w/ Rnase & Dnase).
    3. Incubate at 37 °C, overnight.
    4. Extract with 1 volume (vol.) of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1); vortex 15 sec and spin for 1 min and then extract top aqueous layer.
    5. Repeat phenol: chloroform: isoamyl alcohol extraction.
    6. Extract with 1 vol. of chloroform: IAA (24:1).
    7. Add NaCl to 0.3 M (*Do not use NaOAc as it will precipitate DNA into a slurry!).
    8. Add 2 vol. of cold EtOH (should see DNA precipitate into cloud).
    9. Prepare glass pipette with hook at the end.
    10. Remove DNA by stirring glass pipette into Eppendorf.
    11. Carefully wash or remove pellet from pipette with 70% EtOH and into new eppendorf; dry pellet.
    12. Dissolve DNA into 100 μl of TE or ddH2O. 
    13. Add 10 μl NaOAC and 220 μl EtOH.
    14. Spin for 15 min at max speed at 4 °C.
    15. Wash pellet with 70% EtOH and spin at max speed at RT for 5 min.
    16. Dry pellet and resuspend in ddH2O (i.e. 50 μl).

  2. Transgene PCR detection
    1. To detect transgene, using primers that span the promoter and cDNA sequence or primers that span the Tag sequence such as Myc, GFP if used in the transgene.
    2. PCR set up
      X μl       RAPD+ (make up to 20 μl)
      2 μl       DNA
      1 μl       F primer (20 μM)
      1 μl       R primer (20 μM)
      1 μl       Tag polymerase
    3. PCR program
      94 °C              1 min
      94 °C              30 sec
      54 °C              2 min
      73 °C              1 min
                             go to ii. 5x
      94 °C              30 sec
      55 °C              30 sec
      73°C               1 min
                             go to vi. 35x
      4 °C                hold
                             end
      Run 2-5 μl pcr to check the yield.

Recipes

  1. 1x RAPD buffer
    1.55 ml    150 mM MgCl2
    1.5 ml      1 M Tris (pH 8.3)
    7.5 ml      1 M KCl
    1.5 ml      0.1% Gelatine (heat gelatin to dissolve completely)
    12.05 ml
    Add 88 ml H2O and autoclave at 121 °C for 20 min. Store at 4 °C.
  2. RAPD+ (100 ml)
    30 μl        dATP
    30 μl        dCTP
    30 μl        dGTP
    30 μl        dTTP (each 100 mM)
    150 μl      BSA (20 mg/ml)
    Aliquot and store at -80 °C.
  3. PCR lysis buffer
    1x RAPD buffer
     0.3 %          Tween 20
    0.3%            NP40
    100 μg/ml     Proteinase K
    Store at -20 °C.

Acknowledgments

This protocol was modified from the original protocol by Julie Lefebvre and developed in the Michael Granato Lab at University of Pennsylvania, Philadelphia, USA. This work was supported by NIH grant R01HD037975.

简介

Transgenic zebrafish are very useful genetic tools to study various biological processes. Identification the right transgene founder and the subsequent transgenic animals are always tedious and time consuming. This protocol provides a relatively rapid and easy method to identify the founder parent using a clutch of embryos.

材料和试剂

  1. 斑马鱼胚胎
  2. MeOH
  3. 苯酚
  4. 氯仿
  5. 异戊醇(IAA)
  6. NaCl
  7. KCl
  8. MgCl 2
  9. EtOH
  10. TE
  11. 吐温20
  12. NaOAC
  13. 明胶
  14. NP40
  15. 蛋白酶K.
  16. ddH 2 O
  17. 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)
  18. 引物(定制从IDT订购)
  19. 1x RAPD缓冲区(参见配方)
  20. RAPD + (请参阅配方)
  21. PCR裂解缓冲液(参见配方)

设备

  1. PCR热循环仪
  2. 孵化器
  3. 玻璃吸管
  4. 去除MeOH和干胚胎在55°C孵化器。

程序

  1. 收集胚胎
    应检测25-40个转基因胚胎的组,在40个胚胎的离合器中,在MeOH中固定,在-20℃储存。
    1. 去除MeOH和干胚胎在55°C孵化器。
    2. 加入10μl/裂解缓冲液(w/Rnase& Dnase)的胚胎。
    3. 在37℃孵育过夜。
    4. 用1体积(体积)的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)提取; 涡旋15秒并旋转1分钟,然后提取顶部水层。
    5. 重复苯酚:氯仿:异戊醇萃取。
    6. 提取1 vol。 的氯仿:IAA(24:1)。
    7. 加入NaCl至0.3M(*不使用NaOAc,因为它会将DNA沉淀成浆液!)。
    8. 添加2 vol。 的冷EtOH(应该看到DNA沉淀成云)。
    9. 准备玻璃吸管与钩在末端。
    10. 通过搅拌玻璃吸管除去DNA通过Eppendorf。
    11. 小心地从移液管用70%乙醇洗涤或移除颗粒,并进入新的eppendorf; 干颗粒。
    12. 将DNA溶解于100μlTE或ddH 2 O中。
    13. 加入10μlNaOAC和220μlEtOH。
    14. 在4℃以最大速度旋转15分钟。
    15. 用70%EtOH洗涤沉淀并在室温下以最大速度旋转5分钟。
    16. 干沉淀并重悬于ddH 2 O(即50μl)中。

  2. 转基因PCR检测
    1. 为了检测转基因,使用跨越启动子和cDNA序列的引物或跨越Tag序列的引物,例如Myc,GFP(如果在转基因中使用)。
    2. PCR设置
      Xμl       RAPD + (最多20μl)
      2μl       DNA
      1微升       F引物(20μM)
      1微升       R引物(20μM) 1微升      标记聚合酶
    3. PCR程序
      94°C               1分钟
      94°C               30秒
      54°C               2分钟
      73°C               1分钟
                             去ii。 5x
      94°C               30秒
      55°C               30秒
      73°C                1分钟
                             去vi。 35x
      4°C                保持
                              结束
      运行2-5μlpcr检查产量

食谱

  1. 1x RAPD缓冲区
    1.55 ml    150mM MgCl 2/v/v 1.5 ml      1 M Tris(pH 8.3)
    7.5 ml      1 M KCl
    1.5 ml      0.1%明胶(热凝胶完全溶解)
    12.05 ml
    加入88ml H 2 O并在121℃下高压灭菌20分钟。 储存于4°C。
  2. RAPD + (100ml)
    30μl        dATP
    30μl        dCTP
    30μl        dGTP
    30μl        dTTP(各为100mM) 150μl      BSA(20mg/ml) 等分并储存于-80℃
  3. PCR裂解缓冲液
    1x RAPD缓冲区
      0.3%           吐温20
    0.3%             NP40
    100μg/ml     蛋白酶K
    储存于-20°C。

致谢

该协议从Julie Lefebvre的原始协议修改并且在美国宾夕法尼亚大学的Michael Granato实验室中开发。 这项工作是由NIH授权R01HD037975支持。

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免责声明 × 为了向广大用户提供经翻译的内容,www.bio-protocol.org 采用人工翻译与计算机翻译结合的技术翻译了本文章。基于计算机的翻译质量再高,也不及 100% 的人工翻译的质量。为此,我们始终建议用户参考原始英文版本。 Bio-protocol., LLC对翻译版本的准确性不承担任何责任。
Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Jing, L. (2012). Genotyping Transgenic Zebrafish Using Genomic DNA Extracted from Clutch of Embryos (Originally by J. Lefebvre). Bio-protocol Bio101: e181. DOI: 10.21769/BioProtoc.181;
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