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[Bio101] In Situ Hybridization (From the Thisse Method)
[Bio101] 原位杂交(源自Thisse方法)

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Abstract

In situ hybridization is routinely used to examine the gene expression level and location of embryos. This protocol is modified from the Thisse protocol and is a detailed description of the in situ hybridization procedures in zebrafish embryos.

 

Materials and Reagents

  1. Bovine serum albumin (BSA) (Sigma-Aldrich, catalog number: A9418 )
  2. PFA (powder) (Thermo Fisher Scientific)
  3. DEPC (Sigma-Aldrich, catalog number: D5758 )
  4. Glutaradehyde (Sigma-Aldrich, catalog number: G5882 )
  5. Roche anti-DIG AP (Roche Diagnostics, catalog number: 11093274910 )
  6. Torula yeast RNA (Sigma-Aldrich, catalog number: R6225 )
  7. Heparin (Sigma-Aldrich, catalog number: H0777 )
  8. Lamb/Sheep Serum (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 16070-096 )
  9. Formamide (High purity grade)
  10. Methanol
  11. Sodium Citrate
  12. EDTA
  13. NaCl
  14. KCl
  15. MgCl2
  16. Na2HPO4
  17. KH2PO4 
  18. HCl
  19. Tween 20
  20. Citric acid
  21. 1x PBT(made from DEPC H2O) (see Recipes)
  22. Pronase (Roche Diagnostics, catalog number: 10165921001 ) (see Recipes)
  23. NBT/BCIP color substrate (Promega Corporation, catalog number: S3771 ) (see Recipes)
  24. Hybe+ buffer (see Recipes)
  25. Hybe- buffer (see Recipes)
  26. 20x SSC (see Recipes)
  27. 10x PBS (see Recipes)
  28. 4% paraformaldehyde/PBS (see Recipes)
  29. Blocking solution (see Recipes)
  30. Stop solution (see Recipes)
  31. Heat inactivated lamb serum (see Recipes)
  32. Pre-staining buffer (see Recipes)

Equipment

  1. Hybridization Incubator
  2. 1.5 ml tube
  3. 24-well plate
  4. Aluminum foil
  5. Nalgene filter

Procedure

  1. Preparation of embryos
    1. Dechorinate the embryos using pronase. (Add 1 drop of pronase solution to 1 ml of E3). Keep the embryos at room temperature (RT) for 3-5 min (do not let the embryos in pronase solution for too long!).
    2. Pipet the embryos to break the chorion. 
    3. Collect the embryos in 1.5 ml tubes (usually 20 embryos/per tube). 
    4. Remove E3 buffer and rinse embryos with 1 ml of new E3 buffer to get rid of pronase.
    5. Remove all the E3 and add 500 μl of 4% PFA to fix the embryos O/N at 4 °C.

  2. Dehydrate embryos
    1. Remove PFA (collect PFA in waste collecting tube) and wash with PBT three times (use PBT made from DEPC H2O. 400 μl, 10 min each wash, total 3 times).
    2. Equilibrate with methanol to dehydrate the embryos (400 μl, 5 min each wash, three times).
    3. Remove methanol (collect methanol in waste collecting tube).
    4. Add 500 μl to each tube. Store the embryos in at -20 °C (at least 2 h).

      Day 1
  1. Rehydrate embryos
    Wash for 5 min each sequentially in Methanol: PBT (3:1, 1:1, 1:3). (400 μl each wash, use DEPC-PBT.)
    Wash 4x, 5’ each in 100% PBT. (400 μl each wash)
    See note 1 in the end.
    Fix embryos in 4% PFA (+0.2% glutaradehyde) at RT for 20 min.
    Wash 4x, 5’ each in 100% PBT (400 μl each wash).

  2. Hybridization
    Prehybridize embryos in hybe+ buffer (300 μl/tube) at 70 °C for 30 min-3 h.
    Replace prehybe with hybe+ buffer containing the probe(s) of choice. (0.1 ng-1 ng probe/μl hybe+ buffer)
    Incubate o/n at 70 °C.

    Day 2
    Note: After the RNA probe is hybridized to its template, RNA becomes double stranded and is more stable than single stranded. DEPC-PBT is not necessary.
    1. Remove hybe/probe mixture and store at -20 °C. (can be used up to 3x)
    2. Washes
      75% hybe-/25% 2x SSC         15min, 70 °C
      50% hybe-/50% 2x SSC         15min, 70 °C
      25% hybe-/75% 2x SSC         15min, 70 °C
      100% 2x SSC                         15min, 70 °C
      Wash 2 times in 0.2x SSC      30min, 70 °C
      75% 0.2x SSC/ 25% PBT       10min, RT
      50% 0.2x SSC/ 50% PBT       10min, RT
      25% 0.2x SSC/ 75% PBT       10min, RT
      PBT                                         10min, RT
    3. Add blocking solution to block embryos in at RT for several hours (30 min minimum).

  3. Antibody incubation
    1. After incubation, change buffer for antibody solution (1:5,000 dilution of Roche anti-DIG AP in blocking solution, 500 μl/tube), rock on a platform rotator, at 4 °C O/N.

      Day 3
      DIG staining
    1. Wash quickly in PBT. Use 500 μl/tube.
    2. Wash 6x, 15 min in PBT, shaking at RT. 500 μl/tube.
    3. Wash 1x, 5 min in pre-staining buffer (fresh made). 500 μl/tube. Transfer embryos to 24-well plate use plastic pipets.
    4. Change the buffer to staining buffer+ (1 ml/well) to the embryos and wrap the plate with aluminum foil and shake at RT.
      1. Staining buffer+: Add 4.5 µl of NBT and 3.5 µl BCIP to 1 ml pre-staining buffer.
      2. Check new probes every 30 min to 1 h.
      3. When the staining is done, collect the staining buffer waste. Wash the stained embryos with 1 ml 2x PBT.
      4. Stop reaction by washing in stop solution.
      5. Leave the embryos in stop solution (1 ml/well) or fix in 4% PFA.
    5. Store embryos in stop solution or 4% PFA at 4°C in a closed box.
      Note: For embryos older than 20 somite stage, permeabilization with proteinase K is required to allow the probe to enter the cells.
    6. Incubate in Proteinase K (dilute 1 mg/ml stock 100 fold. 100 μl in 10 ml PBT).
      1. Late somitogenesis (14-22 sec): 2-4 min.
      2. 24 hpf: 10 min.
      3. 36/48 hpf: 20 min.
    7. Wash once (quick) in PBT to get rid of the proteinase K (optional) and continue the fixation.

Recipes

  1. Pronase
    30 mg/ml in E3
  2. 20x SSC (pH7.0)
    NaCl              175.3 g
    NaCitrate       88.2 g
    for 1 L
  3. 10x PBS
    To 800 ml ddH2O dissolve
    NaCl             80 g
    KCl               2 g
    Na2HPO4       14.4 g
    KH2PO4        2.4 g
    pH to 7.4 with HCl and add ddH2O to 1 L.
    * Filter 1x PBS through a 0.2 μm Nalgene filter. Store at RT.
  4. 1x PBT
    10x PBS (pH 7.4) to 1x PBS
    Make a 20% Tween stock. The final concentration of Tween for PBT should be 0.1%.
  5. 4% Paraformaldehyde/PBS
    4 g in 100 ml of PBS, dissolve at 650 C, (or microwave while carefully watching)
  6. Hybe+ buffer
    50% Formamide                                         25 ml of 100% stock
    5x SSC                                                      12.5 ml of 20x stock
    0.5 mg ml-1 Torula yeast RNA                     1.25 ml of 20 mg/ml stock
    50 mg ml-1 heparin                                     50 µl of 50 mg/ml stock
    0.1% Tween                                              250 µl of 20% Tween
    ddH2O                                                       up to 50 ml
    50 ml total volume
    pH to 6-6.5 with 1 M citric acid ~460 µl.
    For Hybe-, leave out the torula yeast RNA and the heparin.
  7. Heat inactivated Lamb Serum
    Thaw Lamb Serum and heat inactivate at 55 °C for 3 min. Store in aliquots at -20 °C.
  8. Blocking solution
    100 mg BSA
    1 ml 100% Lamb/Sheep Serum
    50 ml PBT
  9. 2x stop solution
    PBS (pH 5.5)
    EDTA 1 mM
  10. Pre-staining buffer
    10 ml 1 M Tris (pH9.5)
    5 ml 1 M MgCl2
    2 ml 5 M NaCl
    500 µl Tween 20
    to 100 ml with water.
  11. Staining buffer +
  12. NBT/BCIP
    225 µl 50 mg/ml NBT
    175 µl 50 mg/ml BCIP
    to 50 ml w/ staining buffer

Acknowledgments

This protocol was modified from Reference 1, and developed in the Michael Granato Lab at University of Pennsylvania, Philadelphia, USA. This work was supported by NIH grant R01HD037975.

References

  1. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Thisse C1, Thisse B. Nat Protoc. 2008: 3(1):59-69.

简介

原位杂交常规用于检查胚胎的基因表达水平和位置。 该协议是从Thisse协议修改的,并且是斑马鱼胚胎中原位杂交程序的详细描述。

 

材料和试剂

  1. 牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,目录号:A9418)
  2. PFA(粉末)(Thermo Fisher Scientific)
  3. DEPC(Sigma-Aldrich,目录号:D5758)
  4. 戊二醛(Sigma-Aldrich,目录号:G5882)
  5. Roche anti-DIG AP(Roche Diagnostics,目录号:11093274910)
  6. 圆酵母RNA(Sigma-Aldrich,目录号:R6225)
  7. 肝素(Sigma-Aldrich,目录号:H0777)
  8. 羊/绵羊血清(Thermo Fisher Scientific,目录号:16070-096)
  9. 甲酰胺(高纯度级)
  10. 甲醇
  11. 柠檬酸钠
  12. EDTA
  13. NaCl
  14. KCl
  15. MgCl 2
  16. Na 2 HPO 4
  17. KH 2 PO 4
  18. HCl
  19. 吐温20
  20. 柠檬酸
  21. 1x PBT(由DEPC H 2 O制备)(参见配方)
  22. 链霉蛋白酶(Roche Diagnostics,目录号:10165921001)(参见Recipes)
  23. NBT/BCIP彩色底物(Promega Corporation,目录号:S3771)(参见Recipes)
  24. Hybe + buffer(见Recipes)
  25. Hybe - buffer(见Recipes)
  26. 20x SSC(见配方)
  27. 10x PBS(见配方)
  28. 4%多聚甲醛/PBS(参见配方)
  29. 阻塞溶液(参见配方)
  30. 停止解决方案(参见配方)
  31. 热灭活羊肉血清(见Recipes)
  32. 预染色缓冲液(见配方)

设备

  1. 杂交孵化器
  2. 1.5ml管
  3. 24孔板
  4. 铝箔
  5. Nalgene过滤器

程序

  1. 胚胎的制备
    1. 使用链霉蛋白酶使胚胎脱钙。 (向1ml E3中加入1滴链霉蛋白酶溶液)。 保持胚胎在室温(RT)3-5分钟(不要让胚胎在链霉蛋白酶溶液太长时间!)。
    2. 吸取胚胎打破绒毛。 
    3. 收集胚胎在1.5毫升管(通常是20胚胎/每管)。
    4. 删除E3缓冲区,并用1ml新的E3缓冲液漂洗胚胎,以去除链霉蛋白酶。
    5. 删除所有的E3,并添加500微升的4%PFA固定胚胎O/N在4℃
  2. 脱水胚胎
    1. 除去PFA(收集废物收集管中的PFA)并用PBT洗涤三次(使用由DEPC H 2 O400μl制成的PBT,每次洗涤10分钟,共3次)。
    2. 平衡与甲醇脱水胚胎(400μl,每次5分钟,三次)。
    3. 除去甲醇(在废物收集管中收集甲醇)。
    4. 每管加入500μl。 将胚胎存储在-20°C(至少2小时)。

      第1天
  1. 再水化胚胎
    在甲醇:PBT(3:1,1:1,1:3)中依次洗涤5分钟。 (每次400μl,使用DEPC-PBT。)
    在100%PBT中洗涤4次,每次5'。 (每次400μl)
    最后见注1。
    修复胚胎在4%PFA(+ 0.2%戊二醛)在室温20分钟 在100%PBT中洗涤4x,5'(每次洗涤400μl)
  2. 杂交
    在hybe +缓冲液(300μl/管)中预杂交胚胎在70°C下30分钟-3小时。
    用包含所选探针的hybe +缓冲液替换prehybe。 (0.1ng-1ng探针/μlhybe +缓冲液)
    在70℃孵育o/n
    第2天
    注意:RNA探针与其模板杂交后,RNA变成双链并且比单链更稳定。 DEPC-PBT不是必需的。
    1. 取出hybe /探头混合液,-20°C保存。 (可用高达3倍)
    2. 洗涤
      75%hybe-/25%2x SSC          15分钟,70℃
      50%hybe-/50%2x SSC         15分钟,70℃
      25%hybe-/75%2x SSC          15分钟,70℃
      100%2x SSC                        ; 15分钟,70℃
      在0.2x SSC中清洗2次      30分钟,70℃
      75%0.2x SSC/25%PBT       10min,RT
      50%0.2x SSC/50%PBT       10min,RT
      25%0.2x SSC/75%PBT       10min,RT
      PBT                                          10min,RT
    3. 添加封闭溶液,以阻止胚胎在室温几个小时(最少30分钟)。

  3. 抗体孵育
    1. 孵育后,更换抗体溶液缓冲液(1:5,000稀释的Roche抗DIG AP在封闭溶液中,500μl/管),在平台旋转器上在4℃O/N摇动。
      第3天
      DIG染色
    1. 在PBT中快速洗涤。 使用500μl/管。
    2. 在PBT中洗涤6x,15分钟,在室温下摇动。 500μl/管。
    3. 在预染色缓冲液(新鲜制备)中洗涤1次,5分钟。 500μl/管。 转移胚胎到24孔板使用塑料移液管。
    4. 将缓冲液更换为染色缓冲液+(1 ml /孔)至胚胎,并用铝箔包裹平板,在室温下摇动。
      1. 染色缓冲液+:向1ml预染色缓冲液中加入4.5μlNBT和3.5μlBCIP。
      2. 每30分钟至1小时检查一次新探针。
      3. 当染色完成时,收集染色缓冲液废液。 用1ml 2×PBT洗涤染色的胚胎。
      4. 通过在终止溶液中洗涤停止反应。
      5. 离开胚胎停止溶液(1毫升/井)或固定在4%PFA
    5. 存储胚胎在停止溶液或4%PFA在4°C在一个封闭的盒子 注意:对于20岁以上的胚胎阶段,需要用蛋白酶K进行透化以允许探针进入细胞。
    6. 在蛋白酶K中孵育(稀释1mg/ml储备液100倍,在10ml PBT中为100μl)。
      1. 晚期生长(14-22秒):2-4分钟。
      2. 24hpf:10分钟。
      3. 36/48 hpf:20分钟。
    7. 在PBT中清洗一次(快速)以去除蛋白酶K(可选),并继续固定。

食谱

  1. pronase
    30 mg/ml在E3
  2. 20x SSC(pH7.0)
    NaCl               175.3克
    NaCitrate       88.2克
    为1 L
  3. 10x PBS
    向800ml ddH2O溶解
    NaCl              80克
    KCl                2克
    Na2HPO4        14.4 g
    KH2PO4        2.4 g
    用HCl将pH调节至7.4,并将ddH 2 O加至1L *通过0.2μmNalgene过滤器过滤1x PBS。 存储在RT。
  4. 1x PBT
    10x PBS(pH 7.4)至1×PBS
    制作20%的吐温股票。 PBT的吐温的最终浓度应为0.1%
  5. 4%多聚甲醛/PBS
    4g在100ml PBS中,在650℃溶解(或微波,同时仔细观察)
  6. Hybe + 缓冲区
    50%Formamide                                        25毫升100%股票
    5x SSC                         ;                         ;    12.5ml 20x储液
    0.5mg ml -1 Torula酵母RNA                  1.25ml 20mg/ml储液
    50mg ml -1 肝素                                    50μl50mg/ml原液
    0.1%Tween                                              250μl的20%Tween
    ddH 2 O                   ;                         ;        最多50 ml
    50 ml总量
    用1M柠檬酸〜460μl将pH调至6-6.5 对于Hybe-,省去圆酵母酵母RNA和肝素
  7. 热灭活羊羔血清
    解冻羊肉血清和热失活在55°C 3分钟。 以等分试样储存在-20°C
  8. 封锁解决方案
    100 mg BSA
    1 ml 100%羊肉/绵羊血清
    50ml PBT
  9. 2x停止溶液
    PBS(pH 5.5)
    EDTA 1mM
  10. 预染色缓冲液
    10ml 1M Tris(pH9.5)
    5毫升1M MgCl 2溶液 2ml 5M NaCl
    500μlTween 20
    用水稀释至100 ml
  11. 染色缓冲液 +
  12. NBT/BCIP
    225μl50 mg/ml NBT
    175μl50 mg/ml BCIP
    至50ml /染色缓冲液

致谢

该协议从参考文献1修改,并在宾夕法尼亚大学,费城,美国的迈克尔·格兰纳托实验室开发。 这项工作是由NIH授权R01HD037975支持。

参考文献

  1. 高分辨率原位与整体斑马鱼胚胎的杂交。 Thisse C1,Thisse B. Nat Protoc 。 2008:3(1):59-69。
  • English
  • 中文翻译
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引用:Jing, L. (2012). In Situ Hybridization (From the Thisse Method). Bio-protocol Bio101: e179. DOI: 10.21769/BioProtoc.179;
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