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[Bio101] Double In Situ Hybridization (the Fish Method)
[Bio101] 双色荧光原位杂交技术(FISH)   

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本文章节

Abstract

Double in situ hybridization I very useful to examine the relationship between the expression of two genes. But it is tricky because of the cross reaction of two different antibodies. This protocol is a valid method to do double color in situ hybridization in zebrafish embryos.

Materials and Reagents

  1. Methanol
  2. 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (BCIP)
  3. Nitrotetrazolium blue chloride (NBT)
  4. EDTA
  5. INT
  6. Tris
  7. Tween 20
  8. Glycine
  9. Na2HPO4
  10. HCl
  11. NaCl
  12. Sodium Citrate
  13. MgCl2
  14. KCl
  15. PFA
  16. Sheep serum
  17. BSA
  18. Citric acid
  19. Formamide
  20. Dechorionate
  21. Hybe+ buffer (5ml/tube)
  22. Torula Yeast RNA (Sigma-Aldrich, catalog number: R6225)
  23. Heparin (Sigma-Aldrich, catalog number: H0777 )
  24. Lamb Serum (GibcoBRL, catalog number: 16070096 )
  25. Fast Red staining buffer (FRSB) [1 M Tris (pH 8.2), 0.1% Tween]
  26. Proteinase K (Roche Diagnostics, catalog number: 10165921001 )
  27. Fast Red talets (Roche Diagnostics, catalog number: 11496549001 ) or INT/BCIP (Roche Diagnostics, catalog number: 11681460001 )
  28. NBT/BCIP (Promega Corporation, catalog number: S3771 )
  29. Anti-DIG -AP (Roche Diagnostics, catalog number: 11093274910 )
  30. Anti-Fluorescine AP (Roche Diagnostics, catalog number: 11426338910 )
  31. NBT/BCIP (see Recipes)
  32. 1x PBT (see Recipes)
  33. 20x SSC (see Recipes)
  34. 10x PBS (see Recipes)
  35. 4% Paraformaldehyde (see Recipes)
  36. Hybe+ buffer (5ml/tube) (see Recipes)
  37. Heat Inactivated Lamb Serum (see Recipes)
  38. Blocking solution (see Recipes)
  39. Staining buffer (see Recipes)
  40. Stop solution (see Recipes)

Equipment

  1. Rotator
  2. Nalgene filter
  3. Hybridization Incubator

Procedure

  1. Preparation of Embryos
    1. Fix in p-formaldehyde (4%) o/n at 4 °C.
    2. Wash twice in PBT (fresh made stock) and dechorionate.
    3. Wash and equilibrate with methanol (3x, for 5 min each).
    4. Store at -20 °C.

      Day 1
  2. Rehydration of Embryos
    1. Wash for 5 min each in Methanol: PBT sequentially (3:1, 1:1, 1:3).
    2. Wash 4x, 5 min each in 100% PBT.
    3. Incubate in Proteinase K (dilute 1 mg/ml stock 100 fold. 100 μl in 10 ml PBT).
      1. Younger than “bud”: 30 sec.
      2. Early Somitogenesis: 1-2 min.
      3. Late Somitogenesis (14-22 sec): 2-4 min.
      4. 24 hpf: 10 min.
      5. 36/48 hpf: 20 min.
    4. Wash once (quick) in PBT to get rid of the proteinase K. (optional).
    5. Refix for 20 min in 4% p-formaldehyde at room temperature (RT).
    6. Rinse 5x, 5 min in PBT.

  3. Hybridization
    1. Prehybridize embryos in hybe+ buffer (5 ml/tube) at 70 °C for 2-5 h.
    2. Replace prehybe with hybe+ buffer containing the two probes of choice (~150-200 ng of each probe/200 μl hybe+ buffer).
    3. Incubate o/n at 70 °C.

      Day 2
    4. Remove hybe/probe mixture and store at -20 °C (can be used up to 3x).
    5. Washes:
      1. 100% prewarmed hybe- buffer, 10 min, 70 °C.
      2. 75% hybe-/25% 2x SSC, 15 min, 70 °C.
      3. 50% hybe-/50% 2x SSC, 15 min, 70 °C.
      4. 100% 2x SSC, 15 min, 70 °C.
      5. Wash 2 times in 0.2x SSC, 30 min, 70 °C.
      6. 75% 0.2x SSC/ 25% PBT, 10 min, RT.
      7. 50% 0.2x SSC/ 50% PBT, 10 min, RT.
      8. 25% 0.2x SSC/ 75% PBT, 10 min, RT.
      9. PBT, 10 min, RT.
    6. Block embryos in PBT/2% sheep serum/2 mg/ml BSA at RT for 2 h.

  4. First Ab Incubation (anti-fluorescein-AP)
    1. Incubate embryos with 500 μl of antibody solution (1:2,000 dilution) for 2 h at RT or o/n at 4 °C, rocking on a rotator.

  5. Staining the embryos (Fast red method)
    1. Wash excess ab off embryos 6x, 15 min in PBT, shaking at RT.
    2. Wash 2-3x in FRSB (1 M Tris, pH 8.2, 0.1% Tween).
    3. Stain in Fash Red Solution (1 tablet in 2 ml FRSB).
    4. After staining is complete wash 3x, 5 min each at RT in 0.1 M glycine (pH 2.2), 0.1% tween to remove the antibody.
    5. Wash 3-4x in PBT to remove all the glycine.
      Or staining the embryos (INT method)
    1. Wash embryos 2x for 5 min each in staining buffer.
    2. Stain embryos in the following solution: 31.5 μl INT, 35 μl BCIP to 10 ml with staining buffer.
    3. To stop reaction fix for 20 min at RT in 4% PFA.
    4. To get rid of primary ab, wash 3x for 5 min each at RT in 0.1 M glycine (pH 2.2), 0.1% tween 20.
    5. Wash 3x for 15 min each at RT in PBT to remove all the glycine.

  6. Second Ab Incubation (anti-DIG-AP)
    1. Incubate embryos with 500 μl of antibody solution (1:5,000 dilution) o/n, rocking on anutator, at 4 °C or for 2 h at RT.

      Day 3
  7. DIG Staining
    1. Wash quickly in PBT.
    2. Wash 6x, 15 min in PBT, shaking at RT.
    3. Wash 2-3x, 5 min in staining buffer.
    4. Add 90 μl of 50 mg/ml NBT and 70 μl of 50 mg/ml BCIP to 20 ml staining buffer.
    5. Add about 500 ml of staining buffer to embryos and wrap rack in aluminum foil and shake at RT. Check new probes every 30 min to 1 h.
    6. Stop reaction by washing in Stop Solution 3x [PBS (pH 5.5), EDTA 1 mM)] or 4% PFA.
    7. Store embryos in 4% PFA at 4 °C in a closed box.

Recipes

  1. 20x SSC (pH 7.0)
    NaCl            175.3 g
    NaCitrate     88.2 g
    for 1 L
  2. 10x PBS
    To 800 ml ddH2O dissolve
    NaCl               80 g
    KCl                 2 g
    Na2HPO4        14.4 g
    KH2PO4          2.4 g
    pH to 7.4 with HCl and add ddH2O to 1 L.
    * Filter 1x PBS through a .2 μm Nalgene filter. Store at RT.
  3. 1x PBT
    10x PBS (pH 7.4) to 1x PBS
    Make a 20% Tween stock. The final concentration of Tween for PBT should be 0.1%.
  4. 4% Paraformaldehyde/PBS
    4 g in 100 ml of PBS, dissolve at 650 C, (or microwave while carefully watching).
  5. Hybe+ buffer
    50% Formamide 25 ml of 100% stock
    5x SSC 12.5 ml of 20x stock
    0.5 mg/ml Torula Yeast RNA 1.25 ml of 20 mg/ml stock
    50 mg/ml heparin 50 μl of 50 mg/ml stock
    0.1% Tween 250 μl of 20% Tween
    1 M citric acid 460 μl
    50 ml total volume
  6. For Hybe-, leave out the torula yeast RNA and the heparin.
  7. Heat Inactivated Lamb Serum
    Thaw Lamb Serum and heat inactivate at 55 °C for 30 min. Store in aliquots at -20 °C.
  8. Blocking solution
    100 mg BSA (Sigma-Aldrich)
    1 ml 100% Lamb/Sheep Serum
    50 ml PBT
  9. Staining buffer
    10 ml 1 M Tris (pH 9.5)
    5 ml 1 M MgCl2
    2 ml 5 M NaCl
    500 μl Tween 20
    to 100 ml with water
  10. NBT/BCIP
    225 μl 50 mg/ml NBT
    175 μl 50 mg/ml BCIP
    to 50 ml staining buffer
  11. 3x stop solution
    PBS (pH 5.5)
    EDTA 1 mM
  12. Pre-Staining Buffer
    10 ml 1 M Tris (pH 9.5)
    5 ml 1 M MgCl2
    2 ml 5 M NaCl
    500 μl Tween 20
    To 100 ml with water
  13. Satining buffer
  14. NBT/BCIP
    225 μl 50 mg/ml NBT, 175 μl 50 mg/ml BCIP, to 50 ml w/ staining buffer

Acknowledgments

This protocol was modified from the original protocol developed in the Len Zon lab at Boston Children’s Hospital, Boston, USA and supported by NIH grant R01 HL04880-21.

简介

双重原位杂交我非常有用于检查两个基因的表达之间的关系。 但它是棘手的,因为两个不同的抗体的交叉反应。 此协议是在斑马鱼胚胎中进行双重染色原位杂交的有效方法。

材料和试剂

  1. 甲醇
  2. 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)
  3. 硝基四唑蓝氯化物(NBT)
  4. EDTA
  5. INT
  6. Tris
  7. 吐温20
  8. 甘氨酸
  9. Na 2 HPO 4
  10. HCl
  11. NaCl
  12. 柠檬酸钠
  13. MgCl 2
  14. KCl
  15. PFA
  16. 羊血清
  17. BSA
  18. 柠檬酸
  19. 甲酰胺
  20. Dchorionate
  21. Hybe缓冲液(5ml /管)
  22. 圆酵母RNA(Sigma-Aldrich,目录号:R6225)
  23. 肝素(Sigma-Aldrich,目录号:H0777)
  24. 羊乳血清(GibcoBRL,目录号:16070096)
  25. 快速红色染色缓冲液(FRSB)[1M Tris(pH8.2),0.1%Tween]
  26. 蛋白酶K(Roche Diagnostics,目录号:10165921001)
  27. Fast Red talets(Roche Diagnostics,目录号:11496549001)或INT/BCIP(Roche Diagnostics,目录号:11681460001)
  28. NBT/BCIP(Promega Corporation,目录号:S3771)
  29. 抗DIG -AP(Roche Diagnostics,目录号:11093274910)
  30. 抗荧光AP(Roche Diagnostics,目录号:11426338910)
  31. NBT/BCIP(见配方)
  32. 1x PBT(参见配方)
  33. 20x SSC(见配方)
  34. 10x PBS(见配方)
  35. 4%多聚甲醛(见配方)
  36. Hybe缓冲液(5ml /管)(见Recipes)
  37. 热灭活羊羔血清(见食谱)
  38. 阻塞溶液(参见配方)
  39. 染色缓冲液(见配方)
  40. 停止解决方案(参见配方)

设备

  1. 旋转器
  2. Nalgene滤器
  3. 杂交孵化器

程序

  1. 胚胎的制备
    1. 在4℃下固定在p /甲醛(4%)o/n中。
    2. 在PBT(新鲜制备股票)和dechorionate洗涤两次。
    3. 洗涤并用甲醇平衡(3x,每次5分钟)。
    4. 储存于-20°C。

      第1天
  2. 胚胎的补液
    1. 在甲醇:PBT中依次洗涤5分钟(3:1,1:1,1:3)。
    2. 在100%PBT中洗涤4次,每次5分钟。
    3. 在蛋白酶K中孵育(稀释1mg/ml储备液100倍,在10ml PBT中为100μl)。
      1. 年轻比"芽":30秒。
      2. 早期发生:1-2分钟。
      3. 晚期生殖(14-22秒):2-4分钟。
      4. 24hpf:10分钟。
      5. 36/48 hpf:20分钟。
    4. 在PBT中清洗一次(快速)以除去蛋白酶K.(可选)。
    5. 在室温(RT)下在4%的p-甲醛中反应20分钟。
    6. 在PBT中冲洗5x,5分钟。

  3. 杂交
    1. 在hybe +缓冲液(5ml /管)中在70℃预杂交胚胎2-5小时。
    2. 用含有两种选择探针的hybe +缓冲液替换prehybe(〜150-200ng每个探针/200μlhybe +缓冲液)。
    3. 在70℃孵育o/n
      第2天
    4. 取出hybe /探针混合物并储存在-20°C(可使用最多3倍)。
    5. 洗涤:
      1. 100%预热的hybe-缓冲液,10分钟,70℃。
      2. 75%hybe -/25%2x SSC,15分钟,70℃。
      3. 50%hybe -/50%2x SSC,15分钟,70℃。
      4. 100%2x SSC,15分钟,70℃。
      5. 在0.2x SSC,30分钟,70℃洗涤2次。
      6. 75%0.2x SSC/25%PBT,10分钟,RT。
      7. 50%0.2x SSC/50%PBT,10分钟,RT。
      8. 25%0.2x SSC/75%PBT,10分钟,RT。
      9. PBT,10分钟,RT
    6. 在PBT/2%绵羊血清/2mg/ml BSA中在室温下阻断胚胎2小时
  4. 第一Ab孵育(抗荧光素-AP)
    1. 孵育胚胎与500微升的抗体溶液(1:2,000稀释)在室温2小时或o/n在4℃,摇摆在旋转器。

  5. 染色胚胎(快速红色方法)
    1. 洗涤过量ab离开胚胎6x,在PBT中15分钟,在室温摇动。
    2. 在FRSB(1M Tris,pH 8.2,0.1%Tween)中洗涤2-3次。
    3. 在Fash红色溶液(1片在2ml FRSB中)染色。
    4. 染色完成后,在室温下在0.1M甘氨酸(pH 2.2),0.1%吐温中洗涤3次,每次5分钟以除去抗体。
    5. 在PBT中洗3-4次,以去除所有甘氨酸 或染色胚胎(INT方法)
    1. 洗涤胚胎2x染色缓冲液中每次5分钟。
    2. 染色胚胎在以下溶液:31.5微升INT,35微升BCIP到10毫升与染色缓冲液。
    3. 停止反应固定在室温下在4%PFA中反应20分钟。
    4. 为了除去原代ab,在室温下在0.1M甘氨酸(pH 2.2),0.1%吐温20中洗涤3次,每次5分钟。
    5. 在室温下在PBT中洗涤3次,每次15分钟,以除去所有甘氨酸
  6. 第二Ab孵育(抗DIG-AP)
    1. 用500μl抗体溶液(1:5,000稀释)o/n孵育胚胎,在4℃下摇动,在室温下摇动2小时。

      第3天
  7. DIG染色
    1. 在PBT中快速洗涤。
    2. 在PBT中洗涤6x,15分钟,在室温下摇动。
    3. 在染色缓冲液中洗2-3次,5分钟。
    4. 添加90微升50毫克/毫升NBT和70微升50毫克/毫升BCIP到20毫升染色缓冲液。
    5. 向胚胎中加入约500ml染色缓冲液,并在铝箔中包裹并在室温下摇动。 每30分钟至1小时检查一次新探针。
    6. 通过在终止溶液3x [PBS(pH 5.5),EDTA 1mM]中洗涤来终止反应]或4%PFA。
    7. 存储胚胎在4%PFA在4°C在一个封闭的盒子

食谱

  1. 20x SSC(pH 7.0)
    NaCl             175.3克
    NaCitrate     88.2克
    为1 L
  2. 10x PBS
    向800ml ddH2O溶解
    NaCl                80克
    KCl                  2克
    Na 2 HPO 4         14.4 g
    KH 2 PO 4           2.4 g
    用HCl将pH调节至7.4,并将ddH 2 O加至1L *通过.2μmNalgene过滤器过滤1x PBS。 存储在RT。
  3. 1x PBT
    10x PBS(pH 7.4)至1×PBS
    制作20%的吐温股票。 PBT的吐温的最终浓度应为0.1%
  4. 4%多聚甲醛/PBS
    4g在100ml PBS中,在650℃溶解(或微波,同时仔细观察)
  5. Hybe + 缓冲区
    50%甲酰胺25ml的100%股票
    5×SSC 12.5ml 20×储液罐
    0.5mg/ml圆酵母RNA 1.25ml 20mg/ml原液
    50mg/ml肝素50μl50mg/ml股票
    0.1%Tween250μl20%Tween
    1 M柠檬酸460μl
    50 ml总量
  6. 对于Hybe - ,省去圆酵母酵母RNA和肝素。
  7. 热灭活羊羔血清
    解冻羊肉血清和热失活在55°C 30分钟。 以等分试样储存在-20°C
  8. 封锁解决方案
    100mg BSA(Sigma-Aldrich) 1 ml 100%羊肉/绵羊血清
    50ml PBT
  9. 染色缓冲区
    10ml 1M Tris(pH 9.5)
    5毫升1M MgCl 2溶液 2ml 5M NaCl
    500μlTween 20
    至100 ml用水
  10. NBT/BCIP
    225μl50 mg/ml NBT
    175μl50 mg/ml BCIP
    至50ml染色缓冲液
  11. 3x停止溶液
    PBS(pH 5.5)
    EDTA 1mM
  12. 预染色缓冲液
    10ml 1M Tris(pH 9.5)
    5毫升1M MgCl 2溶液 2ml 5M NaCl
    500μlTween 20
    加水至100 ml
  13. Satining缓冲液
  14. NBT/BCIP
    225μl50mg/ml NBT,175μl50mg/ml BCIP,至50ml /染色缓冲液

致谢

该协议从在Len Zon实验室在波士顿儿童医院,波士顿,美国开发并由NIH授权R01 HL04880-21支持的原始协议修改。

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Copyright: © 2017 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Jing, L. (2012). Double In Situ Hybridization (the Fish Method). Bio-protocol Bio101: e178. DOI: 10.21769/BioProtoc.178;
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