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[Bio101] Dig RNA Probe Synthesis and Purification
[Bio101] 地高辛 RNA探针的合成和纯化   

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Abstract

In situ hybridization is an effective method to examine the expression level and location of gene of interest on tissues or cells. The method provided in this protocol is a detailed description of synthesizing antisense probe for in situ hybridization.

Materials and Reagents

  1. CI (Chloroform: Isoamylalcohol = 24:1)
  2. NaOAc
  3. EtOH
  4. LiCl
  5. DEPC H2O
  6. RNasin Plus Protease Inhibitor (Promega Corporation, catalog number: N2611 )
  7. 70% ethanol
  8. PCI (Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol = 25:24:1, volume, Sigma-Aldrich, catalog number: P3802
  9. Glycogen (QIAGEN, catalog number: 158930 )
  10. DIG RNA labeling kit (Roche Diagnostics, catalog number: 11175025910 )
  11. Quick Spin Columns (Roche Diagnostics, catalog number: 1274015 )

Equipment

  1. Standard tabletop centrifuges
  2. RNase-free Eppendorf tube
  3. NanoDrop
  4. Falcon snap cap tube
  5. Water bath

Procedure

  1. Linearizing the cDNA
    1. Cut 5 μg of cDNA in a 100 μl reaction. I use ~2-3 μl of enzyme.
    2. Add 1 volume (100 μl) PCI, vortex and centrifuge 2 min.
    3. Transfer upper phase in a new tube and add 1 volume (100 μl) CI, vortex and centrifuge 1 min.
    4. Transfer upper phase to new tube. Ethanol precipitate this phase.
    5. Add 200 μl EtOH, 10 μl 3 M NaOAc, 0.5 μl 1 mg/ml glycogen and precipitate at -20 °C overnight.
    6. Spin down and wash with 70% ethanol.
    7. Spin again and resuspend in 11 μl nuclease-free water. Take 1 μl of linearized DNA to spec the concentration.

  2. DIG probe synthesis (using the Roche labeling kit)
    * = provided with kit
    1. Add the following to an RNase-free Eppendorf tube (20 μl reaction):
      1 μg linearized DNA template
      2 μl NTP labeling mix*
      2 μl transcription buffer*
      2 μl of RNA polymerase (T7, T3, SP6)*
      1 μl RNase inhibitor*
      RNase-free water to 20 μl total volume.
    2. Mix by flicking tube gently and briefly centrifuge.
    3. Incubate reaction at 37 °C for 2 h.
    4. Add 2 μl DNase I* to the reaction.
    5. Incubate for 15-20 min at 37 °C.

  3. Purifying the DIG probe
    Method 1: Precipitation of RNA probe
    1. Add:
      3.7 μl DEPC H2O
      1.33 μl 7.5 M LiCl
      75 μl EtOH
    2. Precipitate at -20 °C O/N.
    3. Centrifuge 4 °C, 13,000 rpm for 30 min.
    4. Wash pellet in 500 μl 70% DEPC-EtOH (-20 °C).
    5. Centrifuge 5 min, 13000 rpm, RT.
    6. Air dry 5-10 min.
    7. Add:
      50 μl DEPC H2O
      20 units RNasin (0.35 μl)
      Resuspend RNA probe
      Take 2 μl to check on agrose gel and quantify RNA using NanoDrop.
    8. Store RNA probe at -20 °C.
      Method 2: Quick Spin Columns

    1. Remove the quick spin columns from the storage bag and gently invert several times to resuspend the medium.
    2. Remove the top cap from the column and then the bottom cap. Some of the buffer will run out of the column. Discard it.
    3. Place the column in one of the collection tubes (provided in kit) and put both the column and collection tube into a falcon snap cap tube (clear tube, like the ones we use for maxi preps).
    4. Spin the sample in the table-top centrifuge at 1,100 x g for 2 min.
    5. Discard the buffer and if the tip of the column is submerged in the buffer when you take it out of the first spin, then spin it again to make sure that all of the buffer is cleared from the column.
    6. Place the column in a new collection tube (provided with kit).
    7. Add your DIG probe to the center of the column without touching the beads.
    8. Spin for an additional 2 min at 1,100 x g. The eluate from this spin is your DIG probe sample. Transfer it to a clean Eppendorf tube (about 20 μl) and bring up to 100 μl with nuclease-free water. This will give you a concentration of about 100 ng/μl of probe.

Notes

I usually synthesize 3-4 separate dig probe reactions of the same probe and add all of them to the same G50 column. This way you have made quite a bit of probe using only 1 column.

Acknowledgments

This protocol was developed in the Michael Granato Lab at University of Pennsylvania, Philadelphia, USA, and this work was supported by NIH grant R01HD037975.

简介

原位杂交是检测组织或细胞上感兴趣的基因的表达水平和位置的有效方法。 该方案中提供的方法是用于原位杂交的合成反义探针的详细描述。

材料和试剂

  1. CI(氯仿:异戊醇= 24:1)
  2. NaOAc
  3. EtOH
  4. LiCl
  5. DEPC H 2 O
  6. RNasin Plus蛋白酶抑制剂(Promega Corporation,目录号:N2611)
  7. 70%乙醇
  8. PCI(苯酚:氯仿:异戊醇= 25:24:1,体积,Sigma-Aldrich,目录号:P3802)
  9. 糖原(QIAGEN,目录号:158930)
  10. DIG RNA标记试剂盒(Roche Diagnostics,目录号:11175025910)
  11. 快速旋转柱(Roche Diagnostics,目录号:1274015)

设备

  1. 标准台式离心机
  2. 无RNase的Eppendorf管
  3. NanoDrop
  4. Falcon管帽
  5. 水浴

程序

  1. 线性化cDNA
    1. 在100μl反应中切下5μgcDNA。 我使用〜2-3微升的酶。
    2. 加入1体积(100μl)PCI,涡旋并离心2分钟。
    3. 转移上层阶段在一个新的管,加入1体积(100微升)CI,涡旋和离心1分钟。
    4. 将上层转移到新管。 乙醇沉淀该相。
    5. 加入200μlEtOH,10μl3M NaOAc,0.5μl1mg/ml糖原,并在-20℃下沉淀过夜。
    6. 旋转并用70%乙醇洗涤。
    7. 再次旋转并重悬在11μl无核酸酶的水中。 取1μl线性化DNA以确定浓度。

  2. DIG探针合成(使用Roche标记试剂盒)
    * =随套件
    提供
    1. 将以下物质加入到无RNase的Eppendorf管(20μl反应)中:
      1μg线性化DNA模板
      2μlNTP标记混合*
      2μl转录缓冲液*
      2μlRNA聚合酶(T7,T3,SP6)*
      1μlRNA酶抑制剂*
      无RNase的水至总体积为20μl。
    2. 轻轻轻轻轻轻混匀,轻轻离心。
    3. 在37℃下孵育反应2小时。
    4. 加入2μlDNA酶I *到反应中。
    5. 在37℃下孵育15-20分钟。

  3. 净化DIG探头
    方法1:RNA探针沉淀
    1. 添加:
      3.7μlDEPC H sub 2 O 3 / 1.33μl7.5M LiCl
      75μlEtOH
    2. 在-20°C下沉淀O/N。
    3. 在4℃,13,000rpm离心30分钟。
    4. 在500μl70%DEPC-EtOH(-20℃)中洗涤沉淀。
    5. 离心5分钟,13000rpm,RT。
    6. 空气干燥5-10分钟。
    7. 添加:
      50μlDEPC H sub 2 O 2 / 20单位RNasin(0.35μl)
      重悬RNA探针
      取2微升检查agrose凝胶和使用NanoDrop定量RNA。
    8. 将RNA探针储存于-20°C。
      方法2:快速旋转列
    1. 从存储袋中取出快速离心柱,轻轻倒置几次以重悬培养基。
    2. 从柱上取下顶盖,然后取下底盖。 一些缓冲区将用完柱子。 丢弃它。
    3. 将柱放在其中一个收集管(试剂盒中提供)中,并将柱和收集管都放入猎鹰卡口管(透明管,如我们用于maxi制剂的管)。
    4. 将样品在台式离心机中以1,100×g离心2分钟。
    5. 丢弃缓冲液,如果将柱子的尖端浸没在缓冲液中,当您从第一次旋转中取出,然后再次旋转,以确保所有缓冲液从柱中清除。
    6. 将柱置于新的收集管(随试剂盒提供)中。
    7. 将DIG探针添加到色谱柱中心,不要接触珠子。
    8. 以1,100 x g 旋转2分钟。 这种旋转的洗脱液是DIG探针样品。 转移到一个干净的Eppendorf管(约20微升),并用无核酸酶的水达到100微升。 这将使您的浓度约为100 ng /μl的探针。

笔记

我通常合成同一探针的3-4个独立的探针反应,并将它们全部添加到相同的G50柱。 这样,你已经做了相当多的探头,只使用1列。

致谢

该协议是在美国宾夕法尼亚大学的Michael Granato实验室开发的,这项工作由NIH授权R01HD037975支持。

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Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Jing, L. (2012). Dig RNA Probe Synthesis and Purification. Bio-protocol Bio101: e173. DOI: 10.21769/BioProtoc.173;
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