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Tandem affinity purification (TAP) is used to look at protein-protein interaction. Its use relies on generating a fusion protein with a TAP tag on the C- or N- terminal end. In this protocol, a two-step purification of N-terminus TAP-tagged proteins from yeast is described.

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[Bio101] TAP Purification of Yeast Proteins
[Bio101] 酵母蛋白的串联亲和纯化

生物化学 > 蛋白质 > 分离和纯化
作者: Zongtian Tong
Zongtian TongAffiliation: Department of Cell Biology, Center for Metabolism and Obesity Research, Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, USA
For correspondence: tongzong@gmail.com
Bio-protocol author page: a14
1/5/2011, 9071 views, 0 Q&A
DOI: https://doi.org/10.21769/BioProtoc.17

[Abstract] Tandem affinity purification (TAP) is used to look at protein-protein interaction. Its use relies on generating a fusion protein with a TAP tag on the C- or N- terminal end. In this protocol, a two-step purification of N-terminus TAP-tagged proteins from yeast is described.

[Abstract] 串联亲和纯化(TAP)用于观察蛋白质 - 蛋白质相互作用。 其使用依赖于在C-末端或N-末端产生具有TAP标签的融合蛋白。 在该协议中,描述了来自酵母的N末端TAP标记的蛋白质的两步纯化。

Materials and Reagents

  1. Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche Diagnostics)
  2. 100% NP-40 (Sigma-Aldrich)
  3. AcTEV Protease (Life Technologies, Invitrogen™)
  4. IgG Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Science)
  5. Calmodulin affinity resin (Guidechem/Stratagene)
  6. SDS lysis buffer
  7. Beta-ME
  8. Leupeptin
  9. Mg2 acetate
  10. Acetone
  11. BME
  12. EDTA
  13. CaCl2
  14. NaF
  15. Imidazole
  16. NP40 buffer (see Recipes)
  17. IPP150 buffer (see Recipes)
  18. IPP150 calmodulin binding buffer (see Recipes)
  19. TEV cleavage buffer (see Recipes)
  20. IPP150 calmodulin elution buffer (see Recipes)

Equipment

  1. Avestin Homogenizer (Avestin®)
  2. BECKMAN centrifuge and rotor (BECKMAN Coulter)
  3. Polycarbonate tubes
  4. Chromatography column
  5. Microfuge tube
  6. Shaker

Procedure

Day 1

  1. Grow 4,000 OD’s cells (two 2 L cultures in 8 L flasks, grow to 1 OD/ml) 30 °C shaker.
  2. Split to four 1 L centrifuge bottles. Spin at 7,000 rpm for 10 min. While spinning, make 60 ml NP40 Buffer before beginning. 
  3. Wash sample in each bottle with 250 ml cold H2O. Spin at 7,000 rpm for 10 min.
  4. Resuspend all cells in 50 ml total volume cold NP-40 buffer (add 30 ml buffer to first bottle, vortex, transfer all to next bottle, and so on).
  5. Lyse cells using Avestin Homogenizer (4 passes) – see instructions for usage before beginning.
  6. Split lysate into three polycarbonate tubes for 70 Ti Rotor for high-speed spin (~15 ml in each + 1 blank – weigh out to assure accuracy). 
  7. Spin at 100,000 x g for 30 min (37,500 rpm in an ultracentrifuge).
  8. Pour supernatants into a 50 ml conical. 
  9. Take 100 μl cleared lysate sample (100 μl of 50 ml sample = 1x).
  10. Prep IgG Sepharose in microfuge tube.
    a.  1 ml of IgG sepharose slurry (500 μl beads in 1:1 slurry) in 15 ml tube.
    b.  Wash 3x 5 NP-40 lysis buffer w/o PI’s 2 min 4,000 rpm.
  11. Add 1 ml cleared lysate directly to microfuge tube with beads and place beads into 50 ml conical with cleared lysate. Repeat once more with 1 ml more of lysate to obtain all of the beads.
  12. Rotate 2 h in cold room.
  13. Remove 1% of total sample (500 μl), wash 3x 14K for 30 sec with NP-40 buffer, resuspend in 100 μl SDS lysis buffer + 1x PI (IgG bound sample  – this is 5x).
  14. Pour samples over chromatography column in cold room (you will have to do this is stages because the column can only hold 10 ml at one time – keep samples cold while waiting).
    If samples are draining very slowly, it is because nucleic acids are plugging up column so you can always transfer everything to new column to speed things up.
  15. Take 100 μl IgG unbound sample from flowthrough (1x).    
  16. Wash column
    a.  3x 10 ml IPP150
    b.  1x 10 ml TEV Cleavage Buffer + DTT (after last wash, remove rest of TEV Buffer with a gel tip)
  17. Resuspend sepharose in 1 ml TEV Cleavage Buffer + DTT
    a.  Transfer to 1.5 ml Eppendorf.
    b.  Add 300 units TEV protease (30 μl– located in -80 freezer).
    c.  Rotate in cold room overnight

Day 2

  1. Spin down samples at 2,000 x g cold and place supernatant (1 ml) in 15 ml cold conical.
  2. Resuspend sepharose again in 1 ml TEV Cleavage Buffer + DTT.
    a.  Spin 2,000 x g cold, and add supernatant to same 15 ml conical (now you have a total of 2 ml).
  3. Spin 15 ml conical at 5,000 rpm for 5 min to pellet excess beads. Transfer supernatant to new cold 15 ml conical.
  4. Add 6 ml 0.1% Calmodulin binding buffer + BME + 6 μl 1 M CaCl2.
  5. Take 50 μl TEV cleaved sample (50 μl of 8 ml is 6.25x).
  6. To obtain TEV uncleaved sample
    a.   Add 1 ml TEV cleavage buffer to beads, spin 2,000 x g.
    b.  Wash 3x in TEV cleavage buffer and transfer to new tube on last wash.
    c.  Resuspend in 1ml TEV cleavage buffer (1.5 ml total).
    d.  Remove 45 μl of beads (3% of total).
    e.  Resuspended in 100 μl of SDS lysis buffer – 15x.
  7. Preparation of calmodulin beads – use 500 μl bead (1 ml of a 1:1 slurry).
    a.  Wash 3x 1 ml 0.1% calmodulin binding buffer 2 min 14 K in microfuge tube.
  8. Add beads to samples in 15 ml conical as in Step 8 of Day 1.
    a.  Bind samples in cold room 2 h.
  9. Pour samples over chromatography column in cold room.
  10. Take 100 μl calmodulin unbound sample (6.25x).
  11. Wash column
    a.  Wash 2x 1 ml 0.1% calmodulin binding buffer + BME.
    b.  Wash 1x 1 ml 0.02% calmodulin binding buffer + BME.
  12. Elute w/ 1 ml calmodulin elution buffer + BME (eluate 1) - collect in microfuge tube.
  13. Add 700 microliters calmodulin elution buffer + BME.
    a.  Keep in cold room for 10 min.
    b.  Eluate into Eppendorf (eluate 2).
  14. Take 20 μl of eluate 1 – 50x.
  15. Take 14 μl of eluate 2 – 50x.

TCA precipitate eluates

  1. Adjust eluates to 25% TCA w/ 100% TCA.
    a.  333 μl of TCA for 1 ml sample; 233 μl of TCA for 700 μl sample.
  2. Place samples on ice 30 min w/ periodic vortexing.
  3. Spin max cold for 10 min.
  4. Rotate 180 degrees, spin at max speed in the cold for 30 min (since pellet will collect away from center of centrifuge, you want to aspirate from side of eppendorf facing inwards).
  5. Wash 1x 1 ml cold acetone + 0.05 N HCl.
  6. Spin max cold 5 min, rotate 180 degrees spin max cold 5 min.
  7. Wash again w/ cold acetone.
  8. Spin max cold 5 min.
  9. Remove supernatant carefully, dry pellets.
  10. Freeze pellets -80 °C.

Recipes

  1. IPP150 buffer (100 ml)
    2.5 ml 1 M Tris-HCl (pH 8)
    25 mM Tris-HCl (pH 8)
    3 ml 5 M NaCl
    150 mM NaCl
    1 ml 10% NP-40
    0.1% NP-40
    Add H2O to final volume.


  2. TEV cleavage buffer (50 ml)
    0.5 M EDTA
    1.25 ml 1 M Tris-HCl (pH 8) 
    25 mM Tris-HCl (pH 8)
    1.5 ml 5 M NaCl 
    150 mM NaCl
    0.5 ml 10% NP-40
    0.1% NP-40
    50 ml 0.5 M EDTA
    Add H2O to final volume.


  3.  IPP150 calmodulin binding buffer (100 ml) – for 2x buffer without detergent
    2.5 ml 1 M Tris-HCl (pH 8) (25 mM)
    5 ml
    3 ml 5 M NaCl (150 mM)
    6 ml
    100 μl 1 M Mg2 Acetate (1 mM)
    200 μl
    100 μl 1 M Imidazole (1 mM)
    200 μl
    200 μl 1 M CaCl2 (2 mM)
    400 μl
    Add H2O to final volume.
    Divide into two 50 ml aliquots.
    Adjust one 50 ml aliquot to 0.1% NP-40 by adding 500 μl 10% NP-40.
    Adjust other 50 ml aliquot to 0.02% NP-40 by adding 100 μl 10% NP-40.
    Add 0.7 μl of 100% (m/v) beta-ME per ml before use (10 mM beta-ME).
  4. IPP150 calmodulin elution buffer (10 ml) – for 2x buffer without detergent
    0.25 ml 1 M Tris-HCl (pH 8) (25 mM)
    500 μl
    0.3 ml 5 M NaCl (150 mM)
    600 μl
    20 microliters 10% NP-40 (0.02%)
    40 μl
    10 microliters 0.5 M Mg2 Acetate (0.5 mM)
    20 μl
    10 microliters 1 M Imidazole (1 mM)
    20 μl
    400 microliters 0.5 M EGTA (20 mM)
    800 μl
    Add H2O to final volume.
    Add 0.7 μl of 100% (m/v) beta-ME per ml before use (10 mM beta-ME).

  5. NP-40 Buffer (1 L) – for 2x buffer without detergent
    1.61 g Na2HPO4*7H2O (6 mM)
    3.22 g
    0.553 g NaH2PO4*H2O (4 mM) 
    1.106 g
    100 ml 10% NP-40

    8.77 g NaCl (150 mM)
    17.54 g
    4 ml 0.5 M EDTA (4 mM)
    8 ml
    400 microliters leupeptin
    800 μl
    2.1 g NaF (50 mM)
    4.2 g
    0.0552 g Na3VO4 (300 μM)
    0.11 g
    Add H2O to final volume.
    Add the following protease inhibitors per 50 ml NP-40 buffer before use:
    1 complete tablet, EDTA free protease inhibitors (crush tablet first in weigh paper).
    100 microliters 0.5 M PMSF in DMSO.
  6. Samples to take to monitor efficiency
    Cleared lysate, IgG bound, IgG unbound, TEV cleaved, TEV uncleaved, calmoldulin unbound, eluate (pre-TCA precipitation).

Acknowledgments

This protocol has been modified and adapted in the Espenshade Lab, Johns Hopkins School of Medicine. Funding to support different projects that have used this protocol has come from NIH – National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Pancreatic Cancer Action Network, and the American Heart Association.

References

  1. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M. and Seraphin, B. (1999). A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol 17(10): 1030-1032.

材料和试剂

  1. 完全蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche Diagnostics)
  2. 100%NP-40(Sigma-Aldrich)
  3. AcTEV蛋白酶(Life Technologies,Invitrogen TM)
  4. IgG Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare Life Science)
  5. 钙调蛋白亲和树脂(Guidechem/Stratagene)
  6. SDS裂解缓冲液
  7. Beta-ME
  8. 亮肽素
  9. Mg 2+乙酸盐
  10. 丙酮
  11. BME
  12. EDTA
  13. CaCl <2>
  14. NaF
  15. 咪唑
  16. NP40缓冲液(见配方)
  17. IPP150缓冲区(参见配方)
  18. IPP150钙调素结合缓冲液(参见配方)
  19. TEV裂解缓冲液(参见配方)
  20. IPP150钙调蛋白洗脱缓冲液(参见配方)

设备

  1. Avestin均质器(Avestin ®
  2. BECKMAN离心机和转子(BECKMAN Coulter)
  3. 聚碳酸酯管
  4. 色谱柱
  5. Microfuge管
  6. 振动器

程序

第1天

  1. 生长4,000 OD的细胞(两个2L培养物在8L烧瓶中,生长至1OD/ml)30℃振荡器。
  2. 分成四个1升离心机瓶。 以7,000rpm离心10分钟。 在旋转时,在开始之前制备60ml NP40缓冲液。
  3. 用250ml冷H 2 O洗涤每个瓶中的样品。 以7,000rpm离心10分钟。
  4. 重悬所有细胞在50毫升总体积冷NP-40缓冲液(添加30毫升缓冲液到第一瓶,涡旋,转移到下一个瓶子,等等)。
  5. 使用Avestin匀浆器(4次)溶菌细胞 - 开始使用前见使用说明。
  6. 将裂解物裂解成三个聚碳酸酯管,用于70 Ti转子,用于高速旋转(每个〜15ml + 1个空白 - 称量以确保精确度)。
  7. 在100,000×g下旋转30分钟(在超速离心机中37,500rpm)。
  8. 将上清液倒入50 ml锥形瓶中。
  9. 取100μl澄清的裂解物样品(100μl的50ml样品= 1×)。
  10. Prep微量离心管中的Sepharose a。  在15ml试管中加入1ml IgG琼脂糖浆(500μl珠在1:1浆液中) b。  洗涤3×5 NP-40裂解缓冲液w/o PI 2分钟4,000rpm
  11. 添加1毫升澄清裂解物直接微珠与珠和放置珠子到50毫升锥形与澄清的裂解物。 用1ml以上的裂解物重复一次以获得所有珠子。
  12. 在冷室中旋转2小时。
  13. 去除总样品(500μl)的1%,用NP-40缓冲液洗涤3×14K 30秒,重悬于100μlSDS裂解缓冲液+ 1x PI(IgG结合的样品 - 这是5x)中。
  14. 在冷室中将样品倒在色谱柱上(您必须这样做,因为色谱柱一次只能盛10毫升,而样品在等待时冷却)。
    如果样品消耗得非常缓慢,那是因为核酸会堵塞色谱柱,因此您可以随时将所有样品转移到新色谱柱中,以加快速度。
  15. 从流过(1x)中取100μlIgG未结合的样品。    
  16. 洗柱
    a。  3×10ml IPP150
    b。  1×10ml TEV裂解缓冲液+ DTT(最后一次洗涤后,用凝胶尖除去其余的TEV缓冲液)
  17. 在1ml TEV裂解缓冲液+ DTT中重悬悬浮琼脂糖 a。  转移至1.5 ml Eppendorf b。  加入300单位TEV蛋白酶(30μl,位于-80冰箱) c。  在寒冷的房间里过夜

第2天

  1. 将样品以2000×g冷却旋转并将上清液(1ml)置于15ml冷锥中。
  2. 在1ml TEV裂解缓冲液+ DTT中再次悬浮sepharose a。  旋转2,000 x g 冷,并加入上清液到同样15 ml锥形(现在你总共有2毫升)。
  3. 旋转15ml锥形,以5,000rpm离心5分钟,以沉淀过量的珠粒。 转移上清液到新的冷15毫升锥形。
  4. 加入6ml 0.1%钙调蛋白结合缓冲液+ BME +6μl1M CaCl 2。
  5. 取50μlTEV裂解的样品(50μl的8ml是6.25x)。
  6. 获取TEV未裂解样品
    a。   向珠子中加入1 ml TEV裂解缓冲液,旋转2000×g /孔 b。  在TEV裂解缓冲液中洗涤3次,并在最后一次洗涤后转移至新试管 c。  重悬于1ml TEV裂解缓冲液(总共1.5ml)中 d。 取出45微升的珠子(总数的3%) e。  重悬于100μlSDS裂解缓冲液中 - 15x
  7. 钙调蛋白珠的制备 - 使用500μl珠(1ml 1:1的浆液) a。  在微量离心管中洗涤3×1ml 0.1%钙调蛋白结合缓冲液2分钟14K。
  8. 如第1天的步骤8,将珠子加入15ml圆锥形样品中 a。  在冷室2小时绑定样品。
  9. 将样品在冷藏室中通过色谱柱。
  10. 取100μl钙结合蛋白未结合的样品(6.25x)。
  11. 洗柱
    a。  洗涤2x 1ml 0.1%钙调蛋白结合缓冲液+ BME b。  洗涤1×1ml 0.02%钙调蛋白结合缓冲液+ BME
  12. 洗脱w/1ml钙调蛋白洗脱缓冲液+ BME(洗脱液1) - 收集在微量离心管中。
  13. 加入700微升钙调蛋白洗脱缓冲液+ BME a。  在寒冷的房间保持10分钟。
    b。  洗脱至Eppendorf(洗脱液2)。
  14. 取20μl的洗脱液1 - 50x。
  15. 取14μl洗脱液2 - 50x。

TCA沉淀洗脱

  1. 将洗脱液调至25%TCA w/100%TCA a。  对于1ml样品,333μlTCA; 233μlTCA,用于700μl样品
  2. 将样品在冰上30分钟w /定期涡旋。
  3. 旋转最大冷却10分钟。
  4. 旋转180度,在冷的最大速度旋转30分钟(因为沉淀将从离心机的中心收集,你想从eppendorf的面向内吸入)。
  5. 洗涤1×1ml冷丙酮+ 0.05N HCl。
  6. 旋转最大冷却5分钟,旋转180度旋转最大冷却5分钟。
  7. 再次用w /冷丙酮洗涤。
  8. 旋转最大冷5分钟。
  9. 小心地除去上清液,干燥沉淀。
  10. 冻结颗粒-80℃。

食谱

  1. IPP150缓冲液(100ml)
    2.5ml 1M Tris-HCl(pH8)
    25mM Tris-HCl(pH8)
    3ml 5M NaCl
    150mM NaCl
    1ml 10%NP-40
    0.1%NP-40
    将H 2 O添加到最终体积中。


  2. TEV裂解缓冲液(50ml) 0.5 M EDTA
    1.25ml 1M Tris-HCl(pH8)
    25mM Tris-HCl(pH8)
    1.5ml 5M NaCl
    150mM NaCl
    0.5ml 10%NP-40
    0.1%NP-40
    50ml 0.5M EDTA
    将H 2 O添加到最终体积中。


  3.   IPP150钙调素结合缓冲液(100 ml) - 适用于不含洗涤剂的2x缓冲液
    2.5ml 1M Tris-HCl(pH8)(25mM) 5 ml
    3ml 5M NaCl(150mM) 6毫升
    100μl1M Mg 2乙酸盐(1mM)
    200μl
    100μl1M咪唑(1mM)
    200μl
    200μl1M CaCl 2(2mM)
    400μl
    将H 2 O添加到最终体积中。
    分成两个50毫升等分试样。
    通过加入500μl10%NP-40将一个50ml等分试样调节至0.1%NP-40 通过加入100μl10%NP-40将其它50ml等分试样调节至0.02%NP-40 在使用前加入0.7μl100%(m/v)β-ME/ml(10mMβ-ME)
  4. IPP150钙调蛋白洗脱缓冲液(10ml) - 用于没有洗涤剂的2x缓冲液
    0.25ml 1M Tris-HCl(pH8)(25mM) 500微升
    0.3ml 5M NaCl(150mM) 600μl
    20微升10%NP-40(0.02%)
    40微升
    10微升0.5M Mg 2 sub乙酸盐(0.5mM) 20微升
    10微升1M咪唑(1mM)
    20微升
    400微升0.5M EGTA(20mM) 800微升
    将H 2 O添加到最终体积中。
    在使用前加入0.7μl100%(m/v)β-ME/ml(10mMβ-ME)
  5. NP-40缓冲液(1 L) - 用于没有洗涤剂的2x缓冲液
    1.61g Na 2 HPO 4·7H 2 O(6mM)。
    3.22克
    0.553g NaH 2 PO 4 PO 4 * H 2 O(4mM)<
    1.106克
    100ml 10%NP-40

    8.77g NaCl(150mM) 17.54克
    4ml 0.5M EDTA(4mM) 8 ml
    400微升亮抑酶素
    800微升
    2.1克NaF(50mM) 4.2 g
    0.0552g Na 3+ VO 4(300μM)
    0.11克
    将H 2 O添加到最终体积中。
    在使用前每50 ml NP-40缓冲液中加入以下蛋白酶抑制剂:
    1片完整的片剂,EDTA游离蛋白酶抑制剂(粉碎片首先在称重纸) 100微升0.5M PMSF的DMSO溶液
  6. 用于监控效率的样本
    清除裂解物,IgG结合,IgG未结合,TEV切割,TEV未切割,平端蛋白未结合,洗脱(pre-TCA沉淀)。

致谢

该协议已经在约翰霍普金斯医学院的Espenshade实验室中修改和改编。 资助支持不同的项目,使用这个协议来自NIH - 国家心脏,肺和血液研究所,国家过敏和传染病研究所,胰腺癌行动网络和美国心脏协会。

参考文献

  1. Rigaut,G.,Shevchenko,A.,Rutz,B.,Wilm,M.,Mann,M。和Seraphin,B。(1999)。用于蛋白质复合物表征和蛋白质组探索的通用蛋白质纯化方法。 Nat Biotechnol 17(10):1030-1032。
English
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How to cite this protocol: Tong, Z. (2011). TAP Purification of Yeast Proteins. Bio-protocol Bio101: e17. DOI: 10.21769/BioProtoc.17; Full Text



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