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[Bio101] ELISA Measurement of Mouse IL-2
[Bio101] 酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠IL-2   

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本文章节

Abstract

Interleukin-2 (IL-2) is a cytokine secreted by T cells that is essential for immune system activation. This protocol is routinely used for quantification of IL-2 concentration in the supernant of cultured lymphocytes under various stimulations and co-culturing conditions. Upon slightly modification and optimization, this protocol can also be adapted to quantitatively measure other secreted proteins and bio-molecules.

Materials and Reagents

  1. BD OptEIA ELISA set including IL-2 standard, capture antibody, detection antibody/enzyme reagent (BD Biosciences, catalog number: 555148 )
  2. Assay diluent (BD Biosciences, catalog number: 555213 ) or medium made of half RPM1640/10% FCS/PS and half RPM1640
  3. Substrate solution (BD Biosciences, catalog number: 555214 )
  4. NaCl
  5. NaHCO3
  6. Na2CO3
  7. Na2HPO4
  8. KH2PO4
  9. KCl
  10. Tween-20
  11. H2SO4
  12. Coating buffer (see Recipes)
  13. Wash buffer (PBST, pH 7.0) (see Recipes)
  14. Stop solution (see Recipes)

Equipment

  1. ELISA plates (100 plates/case) (BD Biosciences, catalog number: 353279 ) and plate sealers (100 plates/case) (PGC Scientifics, catalog number: 045-826 )
  2. 96-well plates for dilution (SARSTEDT AG, catalog number: 82.1583 )
  3. Multichannel pipette and pipette tips (eBay, catalog number: RT-L200F )
  4. Reagent reservoir (50 ml, 5/bag) (Corning, Costar®, catalog number: 4870 )
  5. ELISA micro plate reader

Procedure

  1. Prepare coating buffer. Dilute capture antibody in coating buffer (1:250 for lot #0000052895) and add 50 μl to each well. Seal plates and incubate overnight at 4 °C.
  2. Wash 3 times.
  3. Block: 200 μl Assay diuent to each well. Room temperature (RT) 1 h.
  4. Wash 3 times.
  5. Add 50 μl standard or sample to each well. RT 2 h.
    Standard: make 800 pg/ml standard in assay diluent from original 135 ng/ml stock and aliquote 0.4 ml each (enough for one assay) and store at -80 °C.
    135 ng/ml x 23.7 μl = 800 p/ml x (3.98+0.0237) ml
    Pg/ml
    0
    50
    100
    200
    400
    800
    800 pg/ml (μl)
    0
    9.38
    18.8
    37.5
    75
    150
    Diluent (μl)
    150
    140.6
    131.2
    112.5
    75
    0
    50 μl each
  6. Wash 5 times.
  7. 15 min before use, dilute detection antibody and avidin-conjugated HRP in Assay diluent (1:330 for lot #0000052895, 8 μl each/6 ml for one 96-well plate). RT 1 h.
  8. Wash 7 times.
  9. Prepare substrate solution (1:1 of A and B, 6 ml for one 96-well plate). Add 50 μl to each well. RT 30 min in dark.
  10. Add 25 μl stop solution. Read at 450 nm and 570 nm within 30 min.

Recipes

  1. Coating buffer (0.1 M carbonate buffer) (pH 9.5)
    4.20 g NaHCO3
    1.28 g Na2CO3 / 0.5 L
    Use within 7 days and store at 4 °C.
  2. Wash buffer (PBST, pH 7.0)
    16 g NaCl
    2.32 g Na2HPO4
    0.4 g KH2PO4
    0.4 g KCl, 1 ml
    Tween-20 / 2 L per two 96-well plates
    Use within 3 days and store at 4 °C.
  3. Stop solution
    2 N H2SO4 (1 M)

References

  1. Huang, G. N., Huso, D. L., Bouyain, S., Tu, J., McCorkell, K. A., May, M. J., Zhu, Y., Lutz, M., Collins, S., Dehoff, M., Kang, S., Whartenby, K., Powell, J., Leahy, D. and Worley, P. F. (2008). NFAT binding and regulation of T cell activation by the cytoplasmic scaffolding Homer proteins. Science 319(5862): 476-481.

简介

白细胞介素-2(IL-2)是由免疫系统激活所必需的T细胞分泌的细胞因子。 该方案常规用于在各种刺激和共培养条件下定量培养的淋巴细胞的上清液中的IL-2浓度。 在稍微修改和优化后,该方案也可以适用于定量测量其他分泌的蛋白质和生物分子

材料和试剂


  1. BD OptEIA ELISA包括IL-2标准,捕获抗体,检测抗体/酶试剂(BD Biosciences,目录号:555148)
  2. 测定稀释剂(BD Biosciences,目录号:555213)或由半RPM1640/10%FCS/PS和半RPM1640制成的培养基
  3. 底物溶液(BD Biosciences,目录号:555214)
  4. NaCl
  5. NaHCO 3
  6. Na 2 CO 3
  7. Na 2 HPO 4
  8. KH sub 2 PO 4
  9. KCl
  10. 吐温-20
  11. H sub 2 SO 4
  12. 包衣缓冲液(见配方)
  13. 洗涤缓冲液(PBST,pH 7.0)(见配方)
  14. 停止解决方案(参见配方)

设备

  1. ELISA平板(100平板/箱)(BD Biosciences,目录号:353279)和平板密封器(100平板/箱)(PGC Scientifics,目录号:045-826)
  2. 用于稀释的96孔板(SARSTEDT AG,目录号:82.1583)
  3. 多通道移液器和移液器吸头(eBay,目录号:RT-L200F)
  4. 试剂库(50ml,5 /袋)(Corning,Costar ,目录号:4870)
  5. ELISA微量板读数器

程序

  1. 准备涂层缓冲液。 在包被缓冲液中稀释捕获抗体(批次#0000052895的1:250),并向每个孔中加入50μl。 密封板并在4℃下孵育过夜。
  2. 洗3次。
  3. 阻断:每孔200μl测定试剂。 室温(RT)1小时。
  4. 洗3次。
  5. 向每个孔中加入50μl标准品或样品。 RT 2 h。
    标准:从原始135 ng/ml原液中制备800 pg/ml标准稀释液,每份0.4 ml(足够进行一次测定),并储存在-80℃。 135ng/ml×23.7μl=800μg/ml×(3.98 + 0.0237)ml
    Pg/ml
    0
    50
    100
    200
    400
    800
    800 pg/ml(μl)
    0
    9.38
    18.8
    37.5
    75
    150
    稀释剂(μl)
    150
    140.6
    131.2
    112.5
    75
    0
    每次50μl
  6. 洗5次。
  7. 使用前稀释检测抗体和抗生物素蛋白缀合的HRP(对于批次#0000052895为1:330,对于一个96孔板为6μl/6ml)。 RT 1小时。
  8. 洗7次。
  9. 准备底物溶液(1:1的A和B,6毫升为一个96孔板)。 每孔加入50μl。 RT 30分钟在黑暗中。
  10. 加入25μl终止液。 在450nm和570nm在30分钟内读数。

食谱

  1. 包被缓冲液(0.1M碳酸盐缓冲液)(pH9.5)
    4.20g NaHCO 3水溶液 1.28g Na 2 CO 3 /0.5L
    7天内使用,4℃存放。
  2. 洗涤缓冲液(PBST,pH 7.0)
    16克NaCl
    2.32g Na 2 HPO 4。 0.4g KH 2 PO 4 sub/
    0.4克KCl,1毫升
    Tween-20/2L /两个96孔板
    3天内使用,4℃保存。
  3. 停止解决方案
    2 H H 2 SO 4子(1 M)

参考文献

  1. Huang,GN,Huso,DL,Bouyain,S.,Tu,J.,McCorkell,KA,May,MJ,Zhu,Y.,Lutz,M.,Collins,S.,Dehoff,M.,Kang, ,Whartenby,K.,Powell,J.,Leahy,D。和Worley,PF(2008)。 NFAT通过胞质支架Homer蛋白结合和调节T细胞活化。 Science 319(5862):476-481。
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Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Huang, G. N. (2012). ELISA Measurement of Mouse IL-2. Bio-protocol Bio101: e169. DOI: 10.21769/BioProtoc.169;
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