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[Bio101] Activation of ER-regulated Fusion Proteins In Vivo
[Bio101] 生物体内ER调节的融合蛋白的活化   

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Abstract

Regulatable protein fusions can be made by attaching the hormone binding domain of the estrogen receptor to the N or C-terminus of a protein of interest. Activation of such ER-fusion proteins in vivo can be achieved by daily administration of a synthetic ligand, 4-hydroxytamoxifen (4OHT), via intraperitoneal (i.p.) injection.

Materials and Reagents

  1. Corn oil (Sigma-Aldrich, catalog number: C8267 )
  2. 200-proof ethanol (Sigma-Aldrich, catalog number: E7023 )
  3. 4OHT (Sigma-Aldrich, catalog number: H7904 )

Equipment

  1. Sonic dismembrator (Thermo Fisher Scientific, model: 100 )
  2. Centrifuges
  3. Hybridization oven

Procedure

  1. Dissolve the 4OHT in ethanol (67 mg/ml) by heating to 48 °C for 10 min.
  2. Mix 4OHT solution with pre-heated (48 °C) sterile corn oil (7.5 mg/ml).
  3. Sonicate 20 sec, at 5 volts then place on ice for 1 min. Repeat 3 times.
  4. Aliquot solution to avoid freeze/thaw cycles and store at -20 °C for up to 1 month.
  5. Prior to i.p. injection, 4OHT should be thawed, sonicated again (3x, 20 sec, at 3 volts) and injected immediately.
    Note: If sustained activity is required daily injections must be performed.

References

  1. Metzger, D. and Chambon, P. (2001). Site- and time-specific gene targeting in the mouse. Methods 24(1): 71-80.
  2. Reuter, J. A. and Khavari, P. A. (2006). Use of conditionally active ras fusion proteins to study epidermal growth, differentiation, and neoplasia. Methods Enzymol 407: 691-702.

简介

可调节的蛋白质融合体可以通过将雌激素受体的激素结合结构域连接到目标蛋白质的N或C末端来制备。 这种ER-融合蛋白在体内的激活可以通过每日通过腹膜内(i.p.)注射施用合成配体4-羟基他莫昔芬(4OHT)来实现。

材料和试剂

  1. 玉米油(Sigma-Aldrich,目录号:C8267)
  2. 200防护乙醇(Sigma-Aldrich,目录号:E7023)
  3. 4OHT(Sigma-Aldrich,目录号:H7904)

设备

  1. 声波破碎仪(Thermo Fisher Scientific,型号:100)
  2. 离心机
  3. 杂交炉

程序

  1. 通过加热至48℃10分钟,将4OHT溶于乙醇(67mg/ml)中
  2. 将4OHT溶液与预热(48℃)无菌玉米油(7.5mg/ml)混合
  3. 超声20秒,然后在冰上放置1分钟。 重复3次。
  4. 等分溶液以避免冻融循环,并在-20°C储存长达1个月。
  5. 腹腔注射前。 注射,4OHT应解冻,再次超声(3x,20秒,3伏)并立即注射。
    注意:如果需要持续的活动,必须每天注射。

参考文献

  1. Metzger,D。和Chambon,P。(2001)。 鼠标中的位点和时间特异性基因定位。 /em> 24(1):71-80。
  2. Reuter,J.A。和Khavari,P.A。(2006)。 使用条件性活性ras融合蛋白来研究表皮生长,分化和瘤形成。 Methods Enzymol 407:691-702。
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Reuter, J. (2011). Activation of ER-regulated Fusion Proteins In Vivo. Bio-protocol Bio101: e164. DOI: 10.21769/BioProtoc.164;
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