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[Bio101] Restriction Enzyme Accessibility Protocol (Mammalian Cells)
[Bio101] 利用限制性内切酶间接分析哺乳动物细胞染色质结构   

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本文章节

Abstract

This protocol describes a method to indirectly assess chromatin structure by using restriction enzyme in mammalian cells, modified from Current Protocols.

Materials and Reagents

  1. Tris
  2. NaCl
  3. MgCl2
  4. DTT
  5. EDTA
  6. SDS
  7. Chloroform
  8. PBS
  9. NP-40
  10. 70% EtOH
  11. NaAc
  12. Phenol/chloroform
  13. Digest buffer (NEB)
  14. Restriction enzyme (NEB)
  15. TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) buffer
  16. Proteinase K (Promega corporation, catalog number: V3021 )
  17. NP-40 (United States biological corporation, catalog number: N3500 )
  18. Lysis buffer (see Recipes)
  19. Wash buffer (see Recipes)
  20. Stop solution (see Recipes)

Equipment

  1. Type B dounce homogenizer
  2. Centrifugation
  3. Falcon 2059 tube

Procedure

  1. Harvest cells (1 x 108 cells for 4 conditions) by centrifugation for 10 min at 1,000 rpm 4 °C.
  2. Wash cells once in x 20 pellet vol. with ice cold PBS by gentle resuspension and transfer to microfuge tube.
  3. Spin for 6 min at 1,000 rpm 4 °C.
  4. Resuspend cells in 1x 1.5 pellet vol. of cell lysis buffer. Add 5 mM DTT immediately prior to use.
  5. Lyse cells with 10 “extremely gentle strokes” of type B Dounce homogenizer (if sample vol. is >500 μl) and transfer to microfuge tube or Falcon 2059 tube (if sample vol. is <500 μl resuspend gently in cell lysis buffer and incubate for 5 min on ice).
  6. Collect nuclei by centrifugation for 5 min tomy/2,500 rpm/4 °C.
  7. Wash nuclei by gentle resuspending in x1.5 pellet vol. of wash buffer.
  8. Collect nuclei by centrifugation for 4 min, 2,000 rpm Tomy.
  9. Resuspend washed nuclei in (1x) digest buffer NEB#2(+5 mM DTT).
  10. Depending on how many conditions resuspend nuclei in desired amount and divide into 200 µl aliquots.
  11. Add enzyme (0, 50, 100,200, 400 units).
  12. Incubate 45 min 37 °C.
  13. Stop rxn with stop sol (300 µl) and put on ice; Vortex briefly after adding stop solution.
  14. Add proteinase K at 0.4 mg/ml from 20 mg/ml stock. Vortex to mix.
  15. Incubate at 37 °C for at least 6 h (or O/N).
  16. Transfer to Falcon 2059 tube and dilute to 2 ml with TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) buffer.
  17. Extract with freshly equilibrated phenol/chloroform. Spin 8,000 rpm SS-34. Repeat extraction 3-4 times until you see nothing at the interface.
  18. Do 1-2 chloroform extraction.
  19. Precipitate DNA with NaAc/EtOH. Rock the tube gently side to side to have DNA tangle form. If DNA is more than 100 µg you should see white precipitate. If less than 100 g freeze at -70 °C for 10 min. spin down the precipitate.
  20. Wash DNA with 2 ml of 70% EtOH.
  21. Air dry DNA ~20 min in the hood (make sure you don’t over dry it).
  22. Resuspend in ~200 μl TE. May increase the vol. depending on the recovery of DNA.
  23. Carefully determine the concentration of gDNA. The solution is very sticky. I typically take 8-10 µl in 800 µl of TE to determine the concentration.
  24. Digest DNA with 2nd restriction enzyme. Typically 100-200 µl digest with 5-10 fold excess of enzyme for overnight. Add 10 µg tRNA and purify the digested DNA by one extraction with freshly equilibrated phenol/chloroform followed by one chloroform extraction. Air dry and resuspend in 30 µl TE buffer.
  25. Run gel with 15 µg of genomic DNA/lane. 10 µg is often ok, but try to use more.
  26. Perform southern blot analysis.

Notes

Do not stop in the middle during steps 1-18.

Recipes

  1. Lysis buffer
    10 mM Tris (pH 7.5)
    10 mM NaCl
    3 mM MgCl2
    0.2% NP-40
    10 mM DTT
  2. Wash buffer
    10 mM Tris (pH 7.5)
    10 mM NaCl
    3 mM MgCl2
    10 mM DTT add right before use.
  3. Stop solution
    10 mM Tris
    25 mM EDTA
    1% SDS

References

  1. Im, H., Grass, J. A., Christensen, H. M., Perkins, A. and Bresnick, E. H. (2002). Histone deacetylase-dependent establishment and maintenance of broad low-level histone acetylation within a tissue-specific chromatin domain. Biochemistry 41(51): 15152-15160.
  2. Tack, L. C., Wassarman, P. M. and DePamphilis, M. L. (1981). Chromatin assembly. Relationship of chromatin structure to DNA sequence during simian virus 40 replication. J Biol Chem 256(16): 8821-8828.

简介

该协议描述了一种方法,通过使用修饰自Current Protocols的哺乳动物细胞中的限制性酶来间接评估染色质结构。

材料和试剂

  1. Tris
  2. NaCl
  3. MgCl 2
  4. DTT
  5. EDTA
  6. SDS
  7. 氯仿
  8. PBS
  9. NP-40
  10. 70%EtOH
  11. NaAc
  12. 苯酚/氯仿
  13. 摘要缓冲区(NEB)
  14. 限制酶(NEB)
  15. TE(Tris 10mM,EDTA 1mM)缓冲液
  16. 蛋白酶K(Promega corporation,目录号:V3021)
  17. NP-40(美国生物公司,目录号:N3500)
  18. 裂解缓冲液(见配方)
  19. 洗涤缓冲液(见配方)
  20. 停止解决方案(参见配方)

设备

  1. B型dounce匀浆器
  2. 离心
  3. 猎鹰2059管

程序

  1. 通过在4℃以1,000rpm离心10分钟来收获细胞(4×10 4个细胞/1个细胞/4个条件)。
  2. 洗涤细胞一次在x 20颗粒体积。 用冰冷的PBS通过温和的再悬浮并转移到微量离心管
  3. 在1,000rpm 4℃下旋转6分钟。
  4. 重悬细胞在1x 1.5颗粒体积。 的细胞裂解缓冲液。 在使用前立即加入5mM DTT
  5. 用B型Dounce匀浆器(如果样品体积>500μl)以10"非常轻柔的敲击"裂解细胞并转移到微量离心管或Falcon 2059管中(如果样品体积<500μl轻轻地重悬于细胞裂解缓冲液 并在冰上孵育5分钟)
  6. 通过离心5分钟tomy/2500rpm/4℃收集细胞核
  7. 通过轻轻地重悬在x1.5丸粒体积中清洗细胞核。 的洗涤缓冲液
  8. 通过离心4分钟,2,000 rpm Tomy收集细胞核
  9. 在(1x)消化缓冲液NEB#2(+ 5mM DTT)中重悬洗涤的核
  10. 取决于多少条件以所需量重悬细胞核并分成200μl等分试样
  11. 添加酶(0,50,100,200,400单位)。
  12. 在37℃下孵育45分钟
  13. 停止rxn与停止sol(300微升)并放在冰上; 添加停止溶液后短暂涡旋。
  14. 从20mg/ml储备液中加入0.4mg/ml的蛋白酶K. 旋涡混合。
  15. 在37℃孵育至少6小时(或O/N)
  16. 转移至Falcon 2059管,用TE(Tris 10mM,EDTA 1mM)缓冲液稀释至2ml
  17. 用新鲜平衡的苯酚/氯仿提取。 旋转8,000rpm SS-34。 重复提取3-4次,直到界面看不到任何东西。
  18. 1-2氯仿萃取。
  19. 用NaAc/EtOH沉淀DNA。 摇动管轻轻地侧面到侧面有DNA缠结形式。 如果DNA超过100μg,你应该看到白色沉淀。 如果在-70℃下小于100g冻结10分钟。 旋转沉淀。
  20. 用2ml 70%EtOH洗涤DNA。
  21. 空气干燥DNA〜20分钟在引擎盖(确保你不要过度干燥)。
  22. 重悬于〜200μlTE。 可能增加vol。 这取决于DNA的回收
  23. 仔细确定gDNA的浓度。 解决方案非常粘。 我通常取800微升TE中的8-10微升,以确定浓度
  24. 用第二限制酶消化DNA。 通常100-200μl用5-10倍过量的酶消化过夜。 加入10μgtRNA,通过用新鲜平衡的苯酚/氯仿萃取一次,然后用一次氯仿萃取纯化消化的DNA。 空气干燥并重悬于30μlTE缓冲液中
  25. 用15μg基因组DNA /泳道运行凝胶。 10μg通常可以,但尝试使用更多。
  26. 进行Southern印迹分析。

笔记

在步骤1-18中不要停在中间。

食谱

  1. 裂解缓冲液
    10mM Tris(pH7.5) 10mM NaCl 3mM MgCl 2/
    0.2%NP-40
    10 mM DTT
  2. 洗涤缓冲液
    10mM Tris(pH7.5) 10mM NaCl 3mM MgCl 2/
    10 mM DTT使用前加入。
  3. 停止解决方案
    10 mM Tris
    25mM EDTA
    1%SDS

参考文献

  1. Im,H.,Grass,J.A.,Christensen,H.M.,Perkins,A。和Bresnick,E.H。(2002)。 组蛋白脱乙酰酶依赖性建立和维持组织特异性染色质域内的广泛低水平组蛋白乙酰化 。 生化学 41(51):15152-15160。
  2. Tack,L.C.,Wassarman,P.M.and DePamphilis,M.L。(1981)。 染色质装配。 在猴病毒40复制期间染色质结构与DNA序列的关系。 J Biol Chem 256(16):8821-8828。
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Im, H. (2011). Restriction Enzyme Accessibility Protocol (Mammalian Cells). Bio-protocol Bio101: e147. DOI: 10.21769/BioProtoc.147;
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