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[Bio101] Polyribosome Profiling
[Bio101] 多聚核糖体模式图   

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本文章节

Abstract

Materials and Reagents

  1. Acetone
  2. Sucrose
  3. Cyclohexamide
  4. Bromophenol blue (BPB)
  5. Urea
  6. Tris-HCl
  7. Tris-Acetate
  8. MgCl2
  9. DTT
  10. NH4Cl
  11. NaCl
  12. DEPC-treated water
  13. Heparin
  14. Stocks (see Recipes)
  15. Lysis buffer (see Recipes)
  16. 60% sucrose (see Recipes)
  17. 7% sucrose solution (see Recipes)
  18. 47% sucrose solution (see Recipes)
  19. Diluted sucrose (see Recipes)
  20. Cyclohexamide to add to cells (see Recipes)

Equipment

  1. Autoclaved, RNase free 500 ml centrifuge bottles (1 per sample)
  2. Autoclaved, RNase free 40 ml centrifuge bottles (1 per sample)
  3. Centrifuges
  4. Colored Epi tubes. Need 30/sample
  5. 15 ml, 50 ml falcon tubes (BD Biosciences, Falcon®)
  6. Ultracentrifuge tubes (Don't autoclave) (Beckman Coulter, catalog number: 344059 )
  7. Beckman JA-10 , JA-20 , and Epi rotors to 4 °C (Beckman Coulter)
  8. Ultra SW-51 buckets to 4 °C
  9. RNase-free glass beads and bead scoop
  10. Foxy fraction collector
  11. BioRad Econo UV monitor (Bio-Rad)
  12. Peristaltic pump

Procedure

Day 1

  1. Make sure all stock solutions are previously prepared.
  2. Inoculate an overnight yeast cell culture from fresh plates.

Day 2

  1. Get together all the necessary equipment prior to starting as this is a time-sensitive experiment.
  2. Aliquot acetone - if you are harvesting protein pellets.
    a.  7 parts acetone to 2 parts water.
    b.  Aliquot 0.9 ml into colored Eppendorf tubes. Label 1-24, P & C. Store at -20 °C.
  3. Pour gradients
    a.  Make sucrose solutions and dilutions.
    b.  Into 15 ml Beckman tubes, add 2.4 ml (3 x 800 μl) of 47% sucrose solution to tube.
    c.  Freeze at -80 °C for 30 min.
    d.  Carefully add 37% same way. Do this carefully. Don't want dimples.
    e.  Repeat with 27% and 17%.
    f.  Add 800 μl 7% gradient 2 times. Add 600 μl 7% solution to very top of tube (add as much as possible).
    g.  Freeze 2-3 h. Transfer to fridge that will not be disturbed and thaw O/N.
  4. Inoculate 100 ml of media with O/N.
  5. Put JA-10 rotor in Beckman. Leave at 4 °C. Move JA-20 and Epi rotors to fridge.
  6. Put ultracentrifuge baskets in fridge.

Day 3

  1. Cell extraction
    1. Take OD of culture. Want between 0.4-0.6.
    2. Get 2 buckets of ice, turn on Marathon to cool down. 
    3. Make lysis buffer and weigh out cyclohexamide.
    4. Pour culture into 500 ml centrifuge bottle containing cyclohexamide. Swirl for 30 sec. and fill 3/4 full with ice.
    5. Balance tubes and centrifuge in JA-l0 7 k for 5 min (5 min from beginning of spin-not to when it gets up to speed). Dump ice and cells out aggressively.
    6. Resuspend cells in 20 ml cold lysis buffer (do NOT throw away remaining lysis buffer -store on ice). Transfer to 40 ml centrifuge tube and spin at 7 K for 3 min. This step is very time sensitive. Balance as fast as possible.
    7. Resuspend pellet in remaining liquid. Measure and bring volume up to 600 μl with lysis buffer in colored Epi tube. A vigorous dumping will leave about 600 μl.
    8. Add glass beads.
    9. Vortex in cold room for 3 min.
    10. Puncture hole in bottom. Stuff on another tube. Put whole thing in 50 ml Falcon, spin in Marathon 2 min at 5 K.
    11. Transfer supernatant to new tube. Centrifuge at 7 K in the JA-18 Eppendorf tube rotor in Beckman for 10 min.
    12. Transfer supernatant to Eppendorf tube.
    13. Start precooling ultracent - turn on, set to 4 °C, pull vacuum. Get rotor out.

  2. Quantitate RNA
    1. Spec 5 μl of RNA in 995 μl water at UV 260 nm.
    2. Calculate volume of extract to load onto gradients: μl loaded = 10 OD units * 1,000 μl ml-1 / (OD260 * dilution factor).
    3. Set aside 1/24th of volume that will be loaded onto gradients for control.

  3. Ultracentrifuging
    1. Load 10 OD units of sup on top of gradient by dropping gently onto top.
    2. Grease all baskets with SPINKOTE for rotor SW-41. Line up in pairs: 1&4, 2&5, 3&6.
    3. Load tubes into baskets. Write down who went where.
    4. Hang baskets onto rotor. Give a little wiggle to make sure they are on securely.
    5. Spin at 39 K for 2.5 h at 4 °C. Decel = 7. This breaks until RPM = 2,000. Once that hits, it stays on hold until you stop it (by hitting stop). Takes approximately 4 min to come down.

  4. Collecting fractions
    1. While samples are centrifuging, make 7% sucrose & 60% sucrose + BPB.
      1. 7% sucrose solution for baselining ~ 50 ml.
      2. 60% sucrose + 100 μl 5 mg/ml bromophenol blue + 100 μl DEPC ~ 50 ml.
    2. Turn on reader about 20 min before the end of the spin.
    3. Once the reader is warmed up, baseline reader:
      1. Turn top of reader to Max Open, sensitivity = 1, noise filter = 1.5. Filter = 5 mm path length, 2 filters. Both need to be same setting (one that reads, one that is a reference).
      2. Turn on pump (not foxy). Fill spill tube with 7% solution. Run 7% through so drips out the fraction collector.
      3. Click "autobaseline" and move pen to position 50 on paper.
      4. Once 7% is moving through reader, move pen manually down to position 20 on chart. Want consistent, straight line.
      5. Turn off paper, move pen up off of paper.
      6. Take out 7% and run dry for a while to get rid of droplets in thin tubing going to fraction collector. Very important to get this dry.
      7. Wipe down seals with D.D. water.
      8. Get blue sucrose moving though large tubing through to metal tube. Once starts dripping, stop pump and wipe off blue drop.
      9. Pump set at 80 x 10. Turn on fraction collector first, then turn on pump – now foxy controls the pump.
      10. Foxy program: E=edit, simple rack, last= 24, collect by drops = 10.
      11. Program #2.
    4. Load acetone tubes onto collector.
    5. When spin is done, take out baskets. If doing more than 2 gradients, store holder in fridge. If only doing two, move holder to bench top. Wipe down rotor and put away.
    6. Take tube out of basket with forcepts. Assemble white seal on top of tube and attach to pump.
    7. Start chart at 60 or 150 (write down speed). Move pen on paper!
    8. On Foxy, hit run - fraction collector will move.
    9. Time between time that measurement is taken (the pen will mark all the way up) and when you see first drop into tube. Write down.
    10. When done, turn off foxy, reverse flow on pump until get the Beckman tube about 1/2 full of blue dye.
    11. Dump off blue sucrose and invert tube. Pellet is at the bottom. Add 500 μl lysis buffers to pellet and resuspend by vortexing hard. Transfer to Epi tube with acetone marked "P". Add 500 μl lysis buffer to 1/24th sample saved on ice before spinning. Transfer to Epi tube with acetone marked "C".
    12. Put all samples in -20 °C O/N.
    13. Clean tube holder and run thin tubing to Foxy dry. Must have no droplet. If there is any problem run 7% through and repeat process with blue.
    14. To clean system run 250 ml D.D. water + 2 drops Ivory Soap through to fraction collector and rinse with 2 x 250 ml of D.D. water.

Day 4

  1. Precipitating samples
    1. Centrifuge acetone samples 5 min at full speed 4 °C. Aspirate sup - pellets may not be visible.
    2. Dry covered to prevent dust from going into tube ~ 10 min or until there is no more acetone fumes. Can save dry pellets in -20 °C until use.

  2. Preparing for westerns
    1. Resuspend pellets in 10 μl loading buffer by flicking tube.
    2. Boil 2-3 min, vortex, quick spin.
    3. Load onto gel (do not load insoluble pellet).
    4. Loading buffer - for protein detection. 3 parts 6 M urea to 1 part 4 x Laemmli buffer.

Recipes

  1. Stocks
    1 M Tris-HCl (pH 7.5 at 4 °C)
    1 M Tris-Acetate (pH 7.0 at 4 °C)
    1 M MgCl2
    1 M DTT (store at -20 °C)
    1 M NH4Cl - do not autoclave.
  2. Lysis buffer
    10 mM Tris-HCI (pH 7.5 at 4 °C)
    0.1 M NaCl
    30 mM MgCl2
    Filter sterilize, at RT.
  3. 60% sucrose
    Make 60% sucrose in DEPC-treated water. Use baked spatulas and baked glassware. Filter sterilize and store at RT.
  4. 7% sucrose solution (200 ml) (enough for 4 samples)
    23.3 ml          60% sucrose, 7%
    10 ml            1 M Tris-Acetate, 50 mM
    10 ml            1 M NH4Cl, 50 mM
    2.4 ml           1 M MgCl2, 12 mM
    0.2 ml           1 M DTT, 1 mM
    0.2 ml           DEPC, 0.1 %
    Up to volume with DEPC-treated water
  5. 47% sucrose solution (200 ml)
    156.7 ml         60% sucrose, 7%
    10 ml            1 M Tris-Acetate, 50 mM
    10 ml            1 M NH4Cl, 50 mM
    2.4 ml           1 M MgCl2, 12 mM
    0.2 ml           1 M DTT, 1 mM
    0.2 ml           DEPC, 0.1 %
    Up to volume with DEPC-treated water
  6. Diluted sucrose (12 ml)
    37% = 9 ml 47% + 3 ml 7%
    27% = 6 ml 47% + 6 ml 7%
    17% = 3 ml 47% + 9 ml 7%
  7. Cyclohexamide to add to cells (assuming cell volume =100 ml)
    5 mg cyclohexamide resuspended in water, 50 μg/ml
  8. Lysis buffer (make 25 ml per sample)
    1.25 mg     cyclohexamide, resuspend in water, 50 μg/ml
    5 mg         heparin, resuspend in water, 200 μg/ml
    50 μl         DEPC, 0.2%

References

  1. Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C. and Sherman, F. (1985). A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome c. Mol Cell Biol 5(8): 1839-1846.

简介

材料和试剂

  1. 丙酮
  2. 蔗糖
  3. 环己酰胺
  4. 溴酚蓝(BPB)
  5. 尿素
  6. Tris-HCl
  7. 三醋酸
  8. MgCl 2
  9. DTT
  10. NH 4 Cl
  11. NaCl
  12. DEPC处理的水
  13. 肝素
  14. 股票(见食谱)
  15. 裂解缓冲液(见配方)
  16. 60%蔗糖(见配方)
  17. 7%蔗糖溶液(见配方)
  18. 47%蔗糖溶液(见配方)
  19. 稀释的蔗糖(见配方)
  20. 环己酰胺添加到细胞中(参见配方)

设备

  1. 高压灭菌,不含RNA酶的500 ml离心瓶(每个样品1个)
  2. 高压灭菌,不含RNase的40 ml离心瓶(每个样品1个)
  3. 离心机
  4. 彩色的Epi管。 需要30 /样品
  5. 15ml,50ml falcon管(BD Biosciences,Falcon)
  6. 超速离心管(不高压灭菌)(Beckman Coulter,目录号:344059)
  7. Beckman JA-10,JA-20和Epi转子至4℃(Beckman Coulter)
  8. Ultra SW-51铲斗至4°C
  9. 无RNA酶的玻璃珠和珠勺
  10. Foxy馏分收集器
  11. BioRad Econo UV监测仪(Bio-Rad)
  12. 蠕动泵

程序

第1天

  1. 确保所有储备溶液都已预先准备好。
  2. 接种来自新鲜平板的过夜酵母细胞培养物

第2天

  1. 在开始之前集合所有必要的设备,因为这是一个时间敏感的实验。
  2. 等分丙酮 - 如果你正在收获蛋白颗粒 a。  7份丙酮至2份水 b。  等分0.9ml到有色的Eppendorf管中。 标签1-24,P& C.储存在-20°C。
  3. 倾斜渐变
    a。  制作蔗糖溶液和稀释液。
    b。  在15ml Beckman管中,向管中加入2.4ml(3×800μl)47%蔗糖溶液 c。  在-80℃冷冻30分钟。
    d。 小心地添加37%相同的方式。 小心这样做。 不想要凹痕。
    e。  用27%和17%重复。
    f。  加入800μl7%梯度2次。 加入600微升7%的溶液到管的顶部(尽可能添加) g。 冷冻2-3小时。 转移到冰箱,不会打扰和解冻O/N
  4. 用O/N接种100ml培养基
  5. 将JA-10转子放在Beckman。 在4°C离开。 将JA-20和Epi转子移动到冰箱
  6. 将超速离心机篮子放在冰箱中。

第3天

  1. 细胞提取
    1. 取文化的OD。 想要在0.4-0.6之间。
    2. 获得2桶冰,打开马拉松冷却下来。
    3. 制作裂解缓冲液,称取环己酰胺。
    4. 将培养物倒入含有环己酰胺的500ml离心瓶中。 旋转30秒。 并填充3/4满冰。
    5. 平衡管和离心机在JA-10 7 k 5分钟(从开始旋转5分钟,不到它的速度)。 把冰和细胞积极地。
    6. 重悬细胞在20ml冷裂解缓冲液(不要丢弃剩余的裂解缓冲液在冰上)。 转移到40毫升离心管,并在7 K旋转3分钟。 这一步是非常时间敏感的。 平衡尽可能快。
    7. 在剩余液体中重悬沉淀。 在彩色Epi管中测量并使用裂解缓冲液使体积达到600μl。 剧烈倾倒将留下约600μl。
    8. 加入玻璃珠。
    9. 在冷室中涡旋3分钟。
    10. 底部有穿刺孔。 东西在另一管。 把整个东西放在50毫升猎鹰,旋转在马拉松2分钟在5 K.
    11. 转移上清至新管。 在7K下在Beckman中的JA-18 Eppendorf管转子中离心10分钟。
    12. 转移上清液到Eppendorf管。
    13. 启动预冷超速 - 打开,设置为4°C,抽真空。 获取转子。

  2. 定量RNA
    1. 规格5微升RNA在995微升水在UV 260 nm。
    2. 计算加载到梯度上的提取物的体积:加载的μl= 10OD单位*1000μlml -1 -1 /(OD 260+稀释因子)。
    3. 留出1/24 th 的音量将被加载到渐变进行控制
  3. 超速离心
    1. 加载10 OD单位的梯度顶部轻轻地落在上面。
    2. 使用SPINKOTE为转子SW-41润滑所有篮子。 成对排列:1& 4,2& 5,3& 6。
    3. 将管子装入篮子。 写下谁去哪里。
    4. 将篮子挂在转子上。 给一点点摆动,以确保他们安全。
    5. 在39°C在4°C旋转2.5小时。 Decel = 7.这断开,直到RPM = 2,000。 一旦命中,它保持暂停,直到你停止(通过击中停止)。 大约需要4分钟。

  4. 收集馏分
    1. 当样品离心时,制备7%蔗糖 60%蔗糖+ BPB。
      1. 7%蔗糖溶液用于基线〜50ml。
      2. 60%蔗糖+100μl5mg/ml溴酚蓝+100μlDEPC〜50ml
    2. 在旋转结束前约20分钟打开读卡器。
    3. 一旦阅读器预热,基线阅读器:
      1. 将读取器的顶部设置为最大开路,灵敏度= 1,噪声滤波器= 1.5。 过滤器= 5mm路径长度,2个过滤器。 两者都需要相同的设置(一个读取,一个作为参考)。
      2. 打开泵(不是油)。 用7%的溶液填充溢出管。 运行7%通过这样滴出馏分收集器。
      3. 点击"autobaseline"并将笔移动到纸上的位置50。
      4. 一旦7%的人通过阅读器移动,手动下移笔到图表上的位置20。 想要一致,直线。
      5. 关闭纸张,将笔抬起离开纸张。
      6. 取出7%,并运行干燥一段时间,以除去液滴在薄管道到馏分收集器。 非常重要的是让这干燥。
      7. 用D.D.擦拭密封。 水。
      8. 获得蓝色蔗糖移动通过大管到金属管。 一旦开始滴水,停止泵和擦拭蓝色滴。
      9. 泵设置在80 x 10.首先打开馏分收集器,然后打开泵 - 现在狡猾控制泵。
      10. Foxy程序:E =编辑,简单机架,最后= 24,通过滴收集= 10。
      11. 程序#2。
    4. 加载丙酮管到收集器。
    5. 当旋转完成后,取出篮子。 如果做超过2个梯度,商店持有人在冰箱。 如果只做两个,移动支架到台面。 擦拭转子并收起。
    6. 把管子从篮子里拿出来。 在管子的顶部组装白色密封并连接到泵。
    7. 以60或150(写下速度)启动图表。 移动笔在纸上!
    8. 在Foxy,命中运行馏分收集器将移动。
    9. 测量时间(笔将一直向上标记)和当您看到第一次落入管中的时间之间的时间。 记下。
    10. 完成后,关闭镰刀,在泵上逆流,直到贝克曼管约1/2满蓝色染料。
    11. 倾倒蓝色蔗糖和倒置管。 颗粒在底部。 加入500μl裂解缓冲液沉淀和通过涡旋硬重悬。 转移到Epi管用丙酮标记"P"。 加入500μl裂解缓冲液到保存在冰上的1/24样品,然后旋转。 转移到丙酮标记为"C"的Epi管。
    12. 将所有样品置于-20°C O/N。
    13. 清洁管架并运行薄管道,使其晾干。 必须没有液滴。 如果有任何问题运行7%通过和重复过程与蓝色。
    14. 清洁系统运行250 ml D.D. 水+ 2滴象牙皂通过级分收集器并用2×250ml D.D. 水。

第4天

  1. 沉淀样品
    1. 在全速4℃下离心丙酮样品5分钟。 吸入支持物可能不可见。
    2. 干燥覆盖,防止灰尘进入管〜10分钟或直到没有更多的丙酮烟雾。 可以在-20°C下保存干颗粒,直到使用
  2. 准备西方
    1. 通过轻弹管在10μl加样缓冲液中重悬沉淀。
    2. 煮2-3分钟,涡旋,快速旋转。
    3. 加载到凝胶(不加载不溶性沉淀)。
    4. 加载缓冲液 - 用于蛋白质检测。 3份6M尿素至1份4×Laemmli缓冲液

食谱

  1. 股票
    1M Tris-HCl(pH7.5,4℃) 1M Tris-醋酸盐(pH7.0,4℃) 1 M MgCl 2
    1 M DTT(-20℃保存)
    1 M NH 4 Cl - 不进行高压灭菌
  2. 裂解缓冲液
    10mM Tris-HCl(pH7.5,4℃) 0.1 M NaCl
    30mM MgCl 2/v/v 过滤灭菌,在室温。
  3. 60%蔗糖 在DEPC处理的水中制备60%蔗糖。 使用烤锅和烤制的玻璃器皿。 过滤灭菌并在RT保存
  4. 7%蔗糖溶液(200ml)(足够4个样品) 23.3 ml           60%蔗糖,7%
    0.2 ml           1 M DTT,1 mM
    0.2 ml           DEPC,0.1%
    用DEPC处理的水达到体积
  5. 47%蔗糖溶液(200ml) 156.7 ml         60%蔗糖,7%
    0.2 ml           1 M DTT,1 mM
    0.2 ml           DEPC,0.1%
    用DEPC处理的水达到体积
  6. 稀释的蔗糖(12ml)
    37%= 9ml 47%+ 3ml 7%
    27%= 6ml 47%+ 6ml 7%
    17%= 3ml 47%+ 9ml 7%
  7. 加入环己酰胺以加入细胞(假设细胞体积= 100ml) 将5mg环己酰胺重悬浮于水中,50μg/ml
  8. 裂解缓冲液(每个样品25ml)
    1.25 mg     环己酰胺,重悬于水中,50μg/ml
    5 mg         肝素,重悬于水中,200μg/ml
    50微升         DEPC,0.2%

参考文献

  1. Baim,S.B.,Pietras,D.F.,Eustice,D.C。和Sherman,F。(1985)。 允许mRNA二级结构的突变减少酿酒酵母的翻译 1-细胞色素c 。 Mol Cell Biol 5(8):1839-1846。
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Zheng, W. (2011). Polyribosome Profiling. Bio-protocol Bio101: e139. DOI: 10.21769/BioProtoc.139;
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