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[Bio101] RNA Extraction from Yeast
[Bio101] 酵母RNA的提取   

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本文章节

Abstract

Materials and Reagents

  1. DEPC treated water
  2. Phenol (TE)/Chloroform (1:1)
  3. 3 M NaAc (pH 5.2)
  4. NaOAc
  5. 10 mM EDTA
  6. 10% SDS
  7. EtOH
  8. Hydroxyquinoline
  9. Complete buffer A (see Recipes)
  10. Buffer A phenol or RNA phenol (see Recipes)
  11. TE phenol (see Recipes)

Equipment

  1. RNase free tube
  2. RNase-free plastic ware
  3. Water bath

Procedure

  1. Harvest Cells
    1. Grow cells to OD600 0.4-0.6 (mid-log phase).
    2. Spin down 10 ml cell cultures for each sample.
    3. Resuspend in 1 ml DEPC treated water, and transfer to RNase free tubes (Note: screw caps are preferred, since snap-caps turns to pop-open in hot bath). 
    4. Spin down cells, pour off supernatant, freeze at -80 °C or use right away.

  2. RNA extraction
    1. Prepare solutions:
      1. Make 0.5 ml buffer A per sample + 1. Aliquot needed amount into RNase-free plastic ware. Add 1% DEPC just before use. Keep at room temp (RT).
      2. Make 1.2 ml Phenol A per sample + 1. Aliqout phenol into RNase free plastic ware. Warm to 65 degrees.
      3. Make 0.5 ml Phenol (TE)/Chloroform (1:1). Aliquot amount needed into RNase free plastic ware. Store at RT.
      4. Prepare RNase free 3 M NaAc (pH 5.2), EtOH, 70% ETOH, and water.
    2. Remove cells from -80 °C and immediately add 0.5 ml buffer A.
    3. Add 600 μl of Phenol A (pre-warm and equilibrated to 65 °C). Add to all samples at once, putting tubes in 65 °C bath. Vortex two tubes at a time for 5 sec each. Keep rotating through tubes for 6 min. 
    4. Spin down tubes for 2 min. Place in water bath.
    5. Carefully remove the phenol layer using an RNase-free blue tip. You will be leaving the aqueous layer in the tube. Store in water bath while finishing extractions and add 600 μl of fresh phenol A.
    6. Vortex tubes for another 6 min. Spin down 2 min. While spinning, label new set of RNase-free Epi tubes (snap-cap). Add 200 μl water and 500 μl Phenol (TE)/Chloroform to each tube.
    7. Take off the aqueous layer and transfer to tubes containing water and phenol/Chloroform. Store in water bath.
    8. Vortex each tube for about 5 sec then spin down for 2 min. While spinning label new set of Epi tubes.
    9. Put tubes back into water bath. Take off top aqueous layer making sure not to get any of the bottom layer (Note: this is important to avoid contaminating DNA, you have to sacrifice ~ 20 μl liquid near the interface). Store in water bath until all are complete.
    10. Add 50 μl RNase-free 3 M NaAc and 1 ml EtOH. Mix. Store on ice 15 min.
    11. Spin down at 4 °C for 15 min.
    12. Wash with 1 ml 70% EtOH(RNase-free). Spin down for 10 min at 4 °C.
    13. Pour off as much EtOH as you can, then add 400 μl water. Let sit in water bath for about 5 min. Add 40 μl NaAc and 800 μl EtOH, mix, and store on ice for 15 min.
    14. Wash with 70% EtOH as before, let dry inverted on paper towel under heat lamp.
    15. Resuspend in 50 μl sterile water (25 μl if original culture volume was under 5 ml).
    16. Let sit in water bath for 15 min. Vortex, spin down.
    17. Dilute 5 μl of RNA into 495 μl water. Determine absorbance at A260 and A240.

Notes

  1. Always wear gloves.
  2. Always use RNase-free tubes, tips, plastic-ware, and solutions. 
  3. Always aliquot stock solutions from RNA shelf into an RNase-free container so you do not contaminate the stock.
  4. When handling RNA, either keep tubes in ice bucket or water bath that is over 50 °C.

Recipes

  1. Complete Buffer A
    a.  Buffer A stock
         50 mM NaOAc
         10 mM EDTA
         Add 16.7 ml 3 M NaOAc (pH 5.2) to 20 ml 0.5 M EDTA to 963.3 ml water.
         Add 0.1 % DEPC, stir O/N, autoclave.
    b.  Complete Buffer A (user solution)
         Add 100 ml 10% SDS to 900 ml of Buffer A stock.
         Add 1 % DEPC just before use.
  2. Buffer A phenol or RNA phenol
    Saturate phenol with Buffer A stock.
    Add 0.1% hydroxyquinoline.
  3. TE Phenol
    Chloroform: Saturate phenol with 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
    Use 50% TE-Phenol and 50% chloroform.

简介


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材料和试剂

  1. DEPC处理的水
  2. 苯酚(TE)/氯仿(1:1)
  3. 3 M NaAc(pH 5.2)
  4. NaOAc
  5. 10mM EDTA
  6. 10%SDS
  7. EtOH
  8. 羟基喹啉
  9. 完成缓冲液A(参见配方)
  10. 缓冲液A苯酚或RNA苯酚(见配方)
  11. TE酚(参见配方)

设备

  1. 无RNase管
  2. 无RNase塑料制品
  3. 水浴

程序

  1. 收获细胞
    1. 使细胞生长至OD 600 = 0.4-0.6(对数中期)。
    2. 每个样品旋转10ml细胞培养物。
    3. 重悬在1ml DEPC处理的水中,并转移到无RNase的管(注意:螺旋帽是优选的,因为snap-caps变成在热浴中弹出)。
    4. 旋转细胞,倒出上清液,在-80°C冷冻或立即使用。

  2. RNA提取
    1. 准备解决方案:
      1. 每个样品制备0.5ml缓冲液A + 1.将所需量的量加入到不含RNase的塑料制品中。 在使用前添加1%DEPC。 保持在室温(RT)。
      2. 每个样品制备1.2ml苯酚A + 1.将Aliqout苯酚加入无RNA酶的塑料制品中。 温热至65度。
      3. 制备0.5ml苯酚(TE)/氯仿(1:1)。 需要等分量的无核糖酶免费塑料制品。 储存在RT。
      4. 制备无RNA酶的3 M NaAc(pH 5.2),EtOH,70%ETOH和水
    2. 从-80℃除去细胞,立即加入0.5ml缓冲液A.
    3. 加入600μl的苯酚A(预热并平衡至65℃)。 立即加入所有样品,将管置于65℃浴中。 每次涡旋两管,每次5秒。 保持旋转通过管6分钟。
    4. 旋转管2分钟。放在水浴中。
    5. 使用无RNase的蓝色小提示小心地去除酚层。你将离开水层在管中。储存在水浴中,同时完成提取,加入600μl新鲜苯酚A.
    6. 涡旋管另外6分钟。旋转2分钟。在旋转时,标记新的无RNA酶的Epi管(snap-cap)。向每个管中加入200μl水和500μl苯酚(TE)/氯仿。
    7. 取出水层,转移到含有水和苯酚/氯仿的管中。储存在水浴中。
    8. 涡旋每个管约5秒,然后旋转2分钟。同时旋转标签新套的Epi管。
    9. 将管放回水浴。脱掉顶层水层,确保不要得到任何底层(注意:这是重要的,以避免污染DNA,你必须牺牲〜20μl液体附近的界面)。储存在水浴中,直到所有完成。
    10. 加入50微升无RNA酶的3 M NaAc和1毫升乙醇。 混合。 存储在冰上15分钟。
    11. 在4℃下旋转15分钟。
    12. 用1ml 70%EtOH(不含RNase)洗涤。 在4℃下旋转10分钟。
    13. 倾倒尽可能多的EtOH,你可以,然后加入400μl水。 让我们坐在水浴约5分钟。 加入40μlNaAc和800μlEtOH,混合,并在冰上储存15分钟。
    14. 如前所述用70%EtOH洗涤,在加热灯下在纸巾上干燥倒置。
    15. 重悬在50μl无菌水(25μl,如果原始培养体积低于5ml)。
    16. 让我们在水浴中坐15分钟。 旋涡,旋转。
    17. 稀释5μl的RNA到495μl水中。 测定A 260和A 240的吸光度。

笔记

  1. 始终戴手套。
  2. 始终使用不含RNase的管,提示,塑料制品和解决方案。
  3. 始终将储备溶液从RNA架子分装到不含RNase的容器中,这样就不会污染原液。
  4. 当处理RNA时,将管保持在冰桶或超过50℃的水浴中。

食谱

  1. 完成缓冲区A
    a。  缓冲A股
         50mM NaOAc
         10 mM EDTA
         将16.7ml 3M NaOAc(pH5.2)加到20ml 0.5M EDTA中,加到963.3ml水中      加入0.1%DEPC,搅拌O/N,高压灭菌。
    b。  完成缓冲区A(用户解决方案)
         向900ml缓冲液A储液中加入100ml 10%SDS      在使用前添加1%DEPC
  2. 缓冲液A酚或RNA酚
    饱和酚与缓冲液A股票。
    加入0.1%羟基喹啉。
  3. TE Phenol
    氯仿:用10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA饱和苯酚 使用50%TE-苯酚和50%氯仿
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Zheng, W. (2011). RNA Extraction from Yeast. Bio-protocol Bio101: e138. DOI: 10.21769/BioProtoc.138;
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