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[Bio101] Yeast in situ Hybridization
[Bio101] 酵母原位杂交   

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本文章节

Abstract

This protocol describes the procedure to label a certain mRNA species in yeast cells with fluorescence probes and prepare slides for visualization under microscope. Probe design/synthesis and microscopy operation are not covered.

Materials and Reagents

  1. HCl
  2. Poly L-Iysine
  3. Formaldehyde
  4. β-mercaptoethanol
  5. Oxalyticase
  6. SDS
  7. 70% ethanol
  8. Formamide
  9. 20x SSC
  10. NaH2PO4 buffer
  11. Triton X-100
  12. 1x PBS-DEPC
  13. DAPI
  14. 40% formamide/2x SSC (see Recipes)
  15. 80% formamide (see Recipes)
  16. Hybridization solution (see Recipes)

Equipment

  1. Incubator
  2. Centrifuges
  3. Glass beaker
  4. Autoclaved glass cylinder
  5. Baked glass pipette
  6. Hotplate
  7. Fume hood
  8. Petri dish
  9. Foil
  10. 50 ml conical tubes
  11. Parafilm
  12. Light microscope

Procedure

Duration: DAY 2: ~3-4 h, DAY 3:~2-3 h after OD reached, DAY 4: ~1-2 h, DAY 5: ~1-2 h.

DAY 0: Prepatation of coverslips

  1. Add 500 ml sterile distilled water to a 1 L glass beaker (measured in an autoclaved glass cylinder).
  2. Add 5 ml 12 N HCl with a baked glass pipette.
  3. Add coverslips to solution one at a time. Try not stick several coverslips together.
  4. Boil for 30 min on hotplate in fume hood.
  5. Wash 10 times with sterile distilled water, swirling.
  6. Add 300 ml sterile distilled water. Autoclave. Store at 4 °C (good for up to a month).
  7. Coat coverslips with poly L-Iysine (which keeps cells at the surface of coverslip).
    1. Use 1 petri dish for each strain used in the in situ hybridization.
    2. Pull out a few coverslips from the autoclaved beaker into one dish and pick them from there.
    3. Place 6 coverslips in each petri dish.(6 coverslips per strain).
    4. Add 200 μl 0.01% poly L-Iysine/coverslip; wait ~ 2 min.
    5. Aspirate off solution leaving a very thin film of solution.
    6. Allow to air dry (~ 2-3 h).
    7. Wash three times with sterile distilled water (not autoclaved), 30 min per wash.
    8. Transfer coverslips to clean dry dish. Stand on edge to dry overnight.

DAY 1: Grow a 5 ml culture in appropriate media O/N on wheel at 30 °C.

DAY 2: In the morning, dilute cultures 1:10 and let them grow.

Check OD600 in the afternoon and dilute the culture acco rdingly into 50 ml of media, so that OD600 in the morning = 0.3-0.5 incubate cultures in the shaker at 30 °C O/N.

DAY 3: Fixation of yeast cells (Note: KEEP CELLS ON ICE!)

  1. Check that yeast grown O/N is at OD600 of 0.2-0.5.
  2. Based on OD600 place "X" volume of cells in 50 ml conical tubes and immediately add the volume of 32% formaldehyde required to give final concentration 3.2%. Mix by inversion.
  3. Turn centrifuge on and cool to 4 °C. Prepare balance tubes.
  4. Incubate at RT for 45 min (mix by inversion every 5-10 min).
  5. Harvest cells (spin at 3,700 rpm/5 min/4 °C).
  6. Pour off supernatant (formaldehyde waste).
  7. Resuspend cells in 5-8 ml ice cold buffer B (keep tubes on ice).
  8. Respin. Pour off supernatant.
  9. Repeat wash with buffer B twice (total = 3 washes).
  10. Last wash: label oxalyticase tubes.
  11. Spheroplasting the cells:
    1. Resuspend cell pellet in 1 ml buffer B+2 μl β-mercaptoethanol (operate in hood).
    2. Transfer resuspended cells to Eppendorf tube containing 0.1 mg oxalyticase.
    3. Keep on ice until all cells transferred.
    4. Incubate at 30 °C for 8 min. Mix by inversion every 2 min.
  12. Spin at 3,500 rpm/4 min/4 °C (keep tubes on ice until the end).
  13. Label plates.
  14. Aspirate off supernatant and wash cells with 1 ml ice cold buffer B.
  15. Respin at 3,500 rpm/5 min/4 °C. Remove supernatant.
  16. Resuspend cells in 700 μl ice cold buffer B.
  17. Spot 100μl of cells per poly-L-Iysine coated coverslip in one petri-dish.
  18. Incubate at 4 °C for 30 min.
  19. Wash coverslips with 25-30 ml ice cold buffer B (2 plates out of fridge at a time).
  20. Check for spheroplast--mix 20 μl 1% SDS + 2 μl cells on slide and check under a light microscope.
  21. Aspirate off Buffer B and add 25-30 ml 70% ethanol/-20 °C.
  22. Store coverslips in 70% ethanol/-20 °C until ready for in situ (usually good for a few weeks or more if ethanol does not evaporate off).

DAY 4: In situ hybridization (Note: Wear Gloves)
Preparation of probes:
1.  Dry down probe in one tube per coverslip (note: In general, hybridize 2 coverslips of each strain desired and protect from light!). Wrap in foil, use bench drawer.
2.  For each coverslip, add in one Eppendorf tube (a master mix can be done, followed by aliquoting 14 μl/tube):
a.  10 μl fluorescently labeled probe (1 ng/μl stock) (ex: ASH1 or lacZ)+
b.  4 μl SSSDNA combined with tRNA (5 mg/ml stock)
3.  Place open tubes in speed vac and dry probe for 30 min (cover centrifuge with foil).
4.  Store at -20 °C until ready to use (may be stored O/N).

Hybridization:
1.  Prepare the following reagents from stock solution (coplin jars hold 10 ml/4 coverslips each): 40% formamide/2x SSC, 80% formamide, hybridization solution. They need to be prepared fresh, and discarded after one use.
2.  Pour 10 ml 2x SSC (DEPC treated) into each coplin jar.
3.  Remove covers lips from ethanol in petri dishes using tweezers. Blot edge of coverslip on kimwipe.
4.  Place 4 coverslips in each coplin jar (note which side has cells).
5.  Incubate coverslips in coplin jars at room temperature for 3-5 min.
6.  Pour off 2x SSC by placing tweezers over coverslips and inverting coplin jars.
7.  Incubate coverslips in 40% formamide/2x SSC at RT for 3-5 min.
8.  Prepare a glass plate covered with parafilm.
9.  Dissolve probe in 12 μl 80% formamide/NaH2PO4 buffer.
10.  Heat at 90 °C for a few minutes. Protect from light and do not vortex.
11.  Add 12 μl hybridization solutions to probe. Mix (stir) with a pipette tip.
12.  Spot 21 μl onto glass plate covered with parafilm.
13.  Remove coverslips from 40% formamide/2x SSC solution. Dab edge of coverslip on kimwipe.
14.  Let coverslips fall face down (where cells are!!!) onto hybridization solution.
       Note: Start from one edge and let fall slowly, practice to avoid bubbles. Do not move coverslips from now on.
15.  After all coverslips are on parafilm, place second piece of parafilm over coverslips and seal the edges. Wrap in aluminum foil.
16.  Incubate at 37 °C for at least 3 h, preferably over night.

DAY 5: Washing and mounting

Note: For the following steps, wrap coplin jars in aluminum foil to protect from light. Prepare 2x the amount of reagents (2 washes).
1.  Pre-warm 40% formamide solution at 37 °C for 30 min before washing.
2.  Place coverslips in coplin jar by pulling parafilm with tweezers.
3.  Wash coverslips in 40% formamide/2x SSC for 15 min at 37 °C.
4.  Repeat #3.
5.  Wash coverslip in 2x SSC /0.1% Triton X-100, 15 min at RT.
6.  Prepare 10 ml 1x PBS-DEPC + 1 μl DAPI per jar.
7.  Wash coverslips in 1x SSC for 15 min at RT.
8.  Repeat #7, prepare slides (labeling).
9.  Wash coverslips in 1x PBS/DAPI.
10.  To mount coverslips on slides, take coverslips out of coplin jars and place face up on kimwipe to blot (mount only 4 at a time and keep the rest protected from light).
11.  Spot 12 μl mounting media onto each slide and return media immediately to -20 °C.
12.  Place coverslips face down on mounting media. Blot twice gently with a kimwipe to remove excess mounting media.
13.  Seal all edges with clear fingernail polish. Store slides at -20 °C.

Notes

  1. Wear gloves all times!!!
  2. Use plastic pipetes.
  3. Use glass cylinders.

Recipes

  1. 40% formamide/2x SSC (pour into an autoclaved glass cylinder)
    #of jars
    2
    3
    4
    5
    6
    7
    8
    Formamide
    8 ml
    12 ml
    16 ml
    20 ml
    24 ml
    28 ml
    32 ml
    20x SSC
    2 ml
    3 ml
    4 ml
    5 ml
    6 ml
    7 ml
    8 ml
    DEPC-H2O
    10 ml
    15 ml
    20 ml
    25 ml
    30 ml
    35 ml
    40 ml

  2. 80% formamide (12 μl for each tube of probe)
    # of coverslips
    8
    10
    12
    24
    Formamide
    80 μl
    100 μl
    120 μl
    240 μl
    1 M NaHPO4 (pH 7.0)
    1 μl
    1.25 μl
    1.5 μl
    3 μl
    DEPC-H2O
    19 μl
    28.5 μl
    57 μl

  3. Hybridization solution
    # of coverslips
    8
    10
    12
    24
    DEPC treated water
    60 μl
    75 μl
    90 μl
    180 μl
    20x SSC (DEPC)
    20 μl
    25 μl
    30 μl
    60 μl
    BSA(20 mg/ml)
    20 μl
    25 μl
    30 μl
    60 μl

References

  1. Chartrand, P., Bertrand, E., Singer, R. H. and Long, R. M. (2000). Sensitive and high-resolution detection of RNA in situ. Methods Enzymol 318: 493-506.
  2. Zheng, W., Finkel, J. S., Landers, S. M., Long, R. M. and Culbertson, M. R. (2008). Nonsense-mediated decay of ash1 nonsense transcripts in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 180(3): 1391-1405.

简介

这个方法是在酵母细胞中描述用荧光探针标记特定的mRNA及准备载玻片在显微镜下观察。这个方法不包括设计、合成探针及显微镜操作。

材料和试剂

  1. HCl
  2. 聚L-赖氨酸
  3. 甲醛
  4. β-巯基乙醇
  5. 氧化酶
  6. SDS
  7. 70%乙醇
  8. 甲酰胺
  9. 20x SSC
  10. NaH 2 PO 4缓冲液
  11. Triton X-100
  12. 1x PBS-DEPC
  13. DAPI
  14. 40%甲酰胺/2x SSC(参见配方)
  15. 80%甲酰胺(见配方)
  16. 杂交溶液(参见配方)

设备

  1. 孵化器
  2. 离心机
  3. 玻璃烧杯
  4. 高压釜玻璃圆筒
  5. 烤玻璃吸管
  6. 热板
  7. 通风柜
  8. 培养皿
  9. 挫败
  10. 50ml锥形管
  11. 石蜡膜
  12. 光学显微镜

程序

持续时间:第2天:〜3-4小时,第3天:OD达到后约2-3小时,第4天:〜1-2小时,第5天:〜1-2小时。

第0天:盖玻片的制备

  1. 向1L玻璃烧杯中加入500ml无菌蒸馏水(在高压灭菌的玻璃圆筒中测量)。
  2. 用烘烤的玻璃吸管加入5 ml 12 N HCl。
  3. 向溶液中一次加入盖玻片。 尝试不要粘几个盖玻片在一起。
  4. 在通风橱中的热板上煮30分钟。
  5. 用无菌蒸馏水洗涤10次,旋动。
  6. 加入300ml无菌蒸馏水。 高压灭菌。 储存在4°C(好一个月)。
  7. 用聚L-赖氨酸(其使细胞保持在盖玻片的表面)涂覆盖玻片
    1. 对于在原位杂交中使用的每种菌株使用1个培养皿。
    2. 从高压灭菌烧杯中取出一些盖玻片到一个盘子,并从那里拿起。
    3. 在每个培养皿中放置6个盖玻片(每个菌株6个盖玻片)。
    4. 加入200μl0.01%聚L-赖氨酸/盖玻片; 等待〜2分钟。
    5. 吸出溶液,留下非常薄的溶液膜。
    6. 让空气干燥(〜2-3小时)。
    7. 用无菌蒸馏水(非高压灭菌)洗涤三次,每次洗涤30分钟。
    8. 转移盖玻片清洁干盘。 站在边缘干燥过夜。

第1天:在30℃在轮上在合适的培养基O/N中培养5ml培养物。

第二天:早晨,稀释培养物1:10,让它们生长。

在下午检查OD 600并将培养物合并稀释到50ml培养基中,使得早晨OD 600 = 0.3-0.5在振荡器中培养30分钟 °CO/N。

第3天:固定酵母细胞(注意:KEEP CELLS ON ICE!)

  1. 检查酵母生长的O/N在OD 600是否为0.2-0.5。
  2. 基于OD 600位置"X"体积的细胞在50ml锥形管中,并立即加入所需的32%甲醛的体积,以得到最终浓度3.2%。 通过反转混合。
  3. 打开离心机并冷却至4°C。 准备平衡管。
  4. 在RT孵育45分钟(通过每5-10分钟反转混合)。
  5. 收获细胞(以3,700rpm/5分钟/4℃旋转)。
  6. 倒出上清液(甲醛废液)。
  7. 重悬细胞在5-8毫升冰冷缓冲液B(保持管在冰上)。
  8. Respin。 倒掉上清液。
  9. 用缓冲液B重复洗涤两次(总共= 3次洗涤)。
  10. 最后一次洗涤:标记oxalyticase管。
  11. 滚球细胞:
    1. 重悬细胞沉淀在1毫升缓冲液B + 2微升β-巯基乙醇(在敞篷操作)。
    2. 将重悬细胞转移到含有0.1mg氧化还原酶的Eppendorf管中。
    3. 保持在冰上,直到所有细胞转移。
    4. 在30℃孵育8分钟。 每2分钟混合一次。
  12. 以3500rpm/4分钟/4℃旋转(将管保持在冰上直到结束)。
  13. 标签板。
  14. 吸出上清液,用1ml冰冷的缓冲液B洗涤细胞。
  15. Respin以3500rpm/5分钟/4℃。 除去上清液。
  16. 重悬细胞在700μl冰冷的缓冲液B.
  17. 在一个陪替氏培养皿中每个聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片上点样100μl细胞。
  18. 在4℃孵育30分钟。
  19. 用25-30ml冰冷缓冲液B(每次2块冰箱中的板)洗涤盖玻片。
  20. 检查原生质 - 混合20微升1%SDS + 2微升细胞在幻灯片上,并在光学显微镜下检查。
  21. 吸出缓冲液B,加入25-30ml 70%乙醇/-20℃。
  22. 将盖玻片储存在70%乙醇/-20°C,直到准备就绪(通常好几个星期或更长时间,如果乙醇不蒸发掉)。

第4天:原位杂交(注意:戴手套)
探针的准备:
1. 每个盖玻片在一个管中干燥探针(注意:通常,杂交每个应变的2个盖玻片和保护免受光!)。包装箔,使用抽屉。
2. 对于每个盖玻片,加入一个Eppendorf管(主混合可以做,然后等分14μl/管):
a。  10μl荧光标记的探针(1ng /μl储备液)(例如:ASH1或lacZ)+
b。  4μlSSSDNA与tRNA(5mg/ml母液)组合
3 放置开放管在speed vac和干探头30分钟(盖箔离心) 4. 储存于-20°C直至准备使用(可储存O/N)。

杂交:
1. 从储备液(coplin瓶子保持10ml/4盖玻片)制备以下试剂:40%甲酰胺/2×SSC,80%甲酰胺,杂交溶液。他们需要准备新鲜,一次使用后丢弃 2. 将10ml 2×SSC(DEPC处理)倒入每个Coplin瓶中 3. 用镊子从培养皿中的乙醇中取出盖子。在kimwipe上盖玻片的边缘。
4. 在每个coplin罐中放4个盖玻片(注意哪一侧有细胞)。
5. 孵育盖玻片在coplin罐在室温下3-5分钟。
6. 通过将镊子放在盖玻片上并颠倒coplin罐倒出2x SSC 7. 孵育盖玻片在40%甲酰胺/2x SSC室温下3-5分钟 8. 准备覆盖有石蜡膜的玻璃板。
9. 将探针溶解在12μl80%甲酰胺/NaH 2 PO 4缓冲液中。
10. 在90℃下加热几分钟。防止光照,不要旋涡。
11. 加入12μl杂交溶液到探针。用移液枪头混合(搅拌)。
12. 将斑点21μl加到用石蜡膜覆盖的玻璃板上。
13. 从40%甲酰胺/2x SSC溶液中取出盖玻片。在kimwipe上盖玻片的边缘。
14. 让盖玻片面朝下(其中细胞是!!!)到杂交溶液。
      注意:从一个边缘开始,缓慢下降,练习避免气泡。以后不要移动盖玻片。
15. 在所有盖玻片在石蜡膜上后,将第二片石蜡膜放在盖玻片上并密封边缘。包裹在铝箔中。
16. 在37℃孵育至少3小时,优选过夜。

第5天:清洗和安装

注意:对于以下步骤,请将铜箔罐放在铝箔中以防止光照。准备2倍量的试剂(2次洗涤)。
1. 在37℃预温40%甲酰胺溶液30分钟,然后洗涤 2. 通过用镊子拉动石蜡膜将盖玻片放在Coplin罐中。
3. 在40%甲酰胺/2x SSC中在37℃下洗涤盖玻片15分钟 4. 重复#3。
5.  在2×SSC/0.1%Triton X-100中洗涤盖玻片,在RT下15分钟 6.  每个瓶准备10毫升1×PBS-DEPC + 1微升DAPI 7.  在室温下,在1x SSC中洗涤盖玻片15分钟。
8.  重复#7,准备幻灯片(标签)。
9.  在1x PBS/DAPI中洗涤盖玻片。
10.  要在幻灯片上安装盖玻片,从柯林斯瓶中取盖玻片,并将脸朝上放在kimwipe上(一次只能安装4个,并保持其他部分不受光照)。
11.  将12μl固定介质点样到每个载玻片上,并立即将培养基返回至-20°C 12.  将盖玻片正面朝下放在安装介质上。 用kimwipe轻轻擦拭两次,以除去多余的装载介质。
13.  用清晰的指甲油密封所有边缘。 将载玻片保存在-20°C。

笔记

  1. 戴手套所有时间!
  2. 使用塑料移液管。
  3. 使用玻璃钢瓶。

食谱

  1. 40%甲酰胺/2×SSC(倒入高压灭菌的玻璃圆筒)中
    #of jars
    2
    3
    4
    5
    6
    7
    8
    甲酰胺

    12 ml
    16 ml
    20ml
    24 ml
    28 ml
    32 ml
    20x SSC
    2 ml
    3 ml
    4 ml
    5 ml
    6毫升
    7 ml
    8 ml
    DEPC-H sub 2 O 10 ml
    15 ml
    20ml
    25 ml
    30 ml
    35 ml
    40 ml

  2. 80%甲酰胺(每个探针管12μl)
    盖玻片数量
    8
    10
    12
    24
    甲酰胺
    80μl
    100微升
    120微升
    240微升
    1 M NaHPO 4(pH 7.0)
    1微升
    1.25μl
    1.5μl
    3微升
    DEPC-H sub 2 O 19微升
    28.5微升
    57微升

  3. 杂交溶液
    盖玻片数量
    8
    10
    12
    24
    DEPC处理水
    60微升
    75微升
    90微升
    180微升
    20x SSC(DEPC)
    20微升
    25μl
    30微升
    60微升
    BSA(20mg/ml) 20微升
    25μl
    30微升
    60微升

参考文献

  1. Chartrand,P.,Bertrand,E.,Singer,R.H.and Long,R.M。(2000)。 原位RNA的敏感和高分辨率检测。 Methods Enzymol 318:493-506。
  2. Zheng,W.,Finkel,J.S.,Landers,S.M.,Long,R.M。和Culbertson,M.R。(2008)。 酿酒酵母中的ash1无义转录物的无义介导的衰变。 a> 180(3):1391-1405。

























  1. Chartrand,P.,Bertrand,E.,Singer,R.H.and Long,R.M。(2000)。 原位RNA的敏感和高分辨率检测。 Methods Enzymol 318:493-506



























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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Zheng, W. (2011). Yeast in situ Hybridization. Bio-protocol Bio101: e134. DOI: 10.21769/BioProtoc.134;
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