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[Bio101] Chloroform-ethanol Isolation Genomic DNA from Mouse Tail
[Bio101] 氯仿-乙醇分离鼠尾基因组 DNA   

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本文章节

Abstract

This protocol describes a simple and fast method to purify genomic DNA from mouse tails using chloroform.

Materials and Reagents

  1. Proteinase K (20 mg/ml) (Life Technologies, Invitrogen™)
  2. KAcO (Sigma-Aldrich)
  3. Chloroform (Mallinckrodt)
  4. Ethanol (Pharmco-Aaper)
  5. Tris
  6. NaCl
  7. EDTA
  8. SDS
  9. Lysis buffer (see Recipes)

Equipment

  1. Centrifuges
  2. Incubator

Procedure

  1. Dilute protease K to 1 mg/ml with lysis buffer (1:20 dilution).
  2. Add 400 μl to each tail, and incubate at 55 °C overnight. After this step the lysate can be still stored in -20 °C, and thaw it completely in water bath and spin down before next step.
  3. Add 75 μl 8 M KAcO, invert.
  4. Add 500 μl cold chloroform (store at -20 °C). Invert 5 times.
  5. Put the tubes in -20 °C for 10 min.
  6. Spin at 13,000 x g for 10 min at 4 °C, transfer 300 μl supernatant to fresh tubes.
  7. Add 617 μl cold ethanol (100%, store at -20 °C) and invert 5 times.
  8. Spin at 13,000 x g for 10 min at 4 °C. Genomic DNA pellete should be visible.
  9. Suck the supernatant and wash the pellete with 700 μl 70% ethanol.
  10. Spin at 13,000 x g for 5 min at 4 °C.
  11. Suck the supernatant, air dry for 10 min. Should be no visible liquid.
  12. Add 100 μl 10 mM Tris (pH 7.4), if DNA not visible, then quantify.
  13. Store genomic DNA in -20 °C.

Recipes

  1. Lysis buffer: (50 ml)
    Stock
    Volume
    Final
    1 M Tris (pH 8.0)
    2.5 ml
    0.05 M
    4 M NaCl
    1.25 ml
    0.1 M
    0.2 M EDTA
    0.75 ml
    3 mM
    10% SDS
    2.5 ml
    0.5%
    H2O
    Make up to 50 ml


Acknowledgments

This protocol was adapted from the original DNA isolation protocol as implemented in the Eric Sibley lab, Department of Pediatrics, Stanford University, CA, USA. Funding from the NIH supported this work.

References

  1. Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

简介

该协议描述了使用氯仿从小鼠尾部纯化基因组DNA的简单和快速的方法。

材料和试剂

  1. 蛋白酶K(20mg/ml)(Life Technologies,Invitrogen TM)
  2. KAcO(Sigma-Aldrich)
  3. 氯仿(Mallinckrodt)
  4. 乙醇(Pharmco-Aaper)
  5. Tris
  6. NaCl
  7. EDTA
  8. SDS
  9. 裂解缓冲液(见配方)

设备

  1. 离心机
  2. 孵化器

程序

  1. 用裂解缓冲液(1:20稀释)将蛋白酶K稀释至1mg/ml。
  2. 向每个尾部加入400μl,并在55℃孵育过夜。 在该步骤后,裂解物可以仍然储存在-20℃,并且在水浴中完全解冻并在下一步骤之前旋转。
  3. 加入75μl8 M KAcO,倒置。
  4. 加入500μl冷氯仿(-20°C储存)。 反转5次。
  5. 将管在-20°C下10分钟。
  6. 在4℃下以13,000×g离心10分钟,将300μl上清液转移到新管中。
  7. 加入617μl冷乙醇(100%,-20°C储存),倒置5次。
  8. 在4℃下以13,000×g离心10分钟。 基因组DNA pellete应该是可见的。
  9. 吸取上清液,用700μl70%乙醇洗涤残渣。
  10. 在4℃下以13,000×g离心5分钟。
  11. 吸取上清液,空气中干燥10分钟。 应无可见液体。
  12. 加入100μl10mM Tris(pH7.4),如果DNA不可见,然后定量
  13. 将基因组DNA储存在-20°C

食谱

  1. 裂解缓冲液:(50ml)
    股票

    最终
    1 M Tris(pH 8.0)
    2.5 ml
    0.05 M/m
    4 M NaCl
    1.25 ml
    0.1 M
    0.2 M EDTA
    0.75 ml
    3 mM
    10%SDS
    2.5 ml
    0.5%
    H sub 2 O
    补足至50ml ml


致谢

该方案改造自在美国加利福尼亚州斯坦福大学儿科系的Eric Sibley实验室中实施的原始DNA分离方案。 NIH的资助支持了这项工作。

参考文献

  1. Sambrook,J.,Fritsch,E。和Maniatis,T。(1989)。 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed。 CSH Laboratory Press,Cold Spring Harbor。
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Fang, L. (2011). Chloroform-ethanol Isolation Genomic DNA from Mouse Tail. Bio-protocol Bio101: e131. DOI: 10.21769/BioProtoc.131;
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