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[Bio101] Protein-ligand Binding Assay by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
[Bio101] 液相色谱-质谱法测定蛋白质与配体结合   

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本文章节

Abstract

Protein-small molecule binding coefficients are determined by quantitative LC-MS in this method. Traditional biochemical plot is consequently used to set up the binding curve between a known protein and a small molecule (<1000 Da) to determine the affinity constant (Kd) and the stoichiometry (Bmax).

Keywords: Ligand binding(配体结合), LC-MS(LC-MS), Molecular filtration(分子过滤), Protein interaction(蛋白质相互作用), Binding Curve(结合曲线)

Materials and Reagents

  1. Purified protein (preferred in solution without any detergent like Tween, Triton, etc., concentration > 1 mM)
  2. Small molecule standard (best of highest available purity/grade, dissolved in the same solution used for proteins, in a 2-fold series of 10x desired concentration)
    Note: To minimize organic solvent effect on binding, the stock solution has to be diluted in the same series in organic solvent first, and then mixed into the aqueous solution to make final standards.
  3. Zeba spin desalting columns micro (Pierce Antibodies, catalog number: 89877 and 89878 )
  4. Methanol (mass spec grade)

Equipment

  1. Microcentrifuge
  2. Quantitative LC-MS (such as HPLC-coupled triple quad)
  3. Eppendorf Protein LoBind tubes (0.5 ml and 1.5 ml)
  4. LCQuan software (Thermo Fisher Scientific)

Procedure

  1. Load 200 μl MS grade water on each Zeba column, and spin at 1,500 x g, 2 min. Put the column on another clean tube.
  2. Mix 10 μl protein and 1 μl small molecule of a serial dilution (usually at least 10 dots to encompass 1,000 fold range) in tubes. 
  3. Pipette mix and incubate at RT for 15 min.
  4. Transfer the mixture in each tube to a Zeba column, let sit 1 min. Then spin down.
  5. Add 40 μl MS grade methanol to each tube, pipette mix and spin at maximal speed 5 min at 4 °C. 
  6. Transfer the supernatant to a glass insert in a vial for mass spec analysis.
  7. Each sample will be loaded 3 times, along with the serial standard solutions of the small molecule at final concentrations used in the binding mixture. Quantification is performed in LCQuan software or other appropriate software.

References

  1. Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M. and Snyder, M. (2010). Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses. Cell 143(4): 639-650.

简介

在该方法中通过定量LC-MS测定蛋白质 - 小分子结合系数。 因此,传统的生化曲线用于建立已知蛋白质和小分子(<1000Da)之间的结合曲线,以确定亲和常数(Kd)和化学计量(Bmax)。

关键字:配体结合, LC-MS, 分子过滤, 蛋白质相互作用, 结合曲线

材料和试剂

  1. 纯化的蛋白质(优选在不含任何洗涤剂如Tween,Triton等的溶液中,浓度> 1mM)
  2. 小分子标准品(最好的最高可用纯度/等级,溶解在用于蛋白质的相同溶液中,以10倍所需浓度的2倍系列)
    注意:为了最小化有机溶剂对结合的影响,首先将储备溶液在有机溶剂中稀释在相同系列中,然后混合到水溶液中以制备最终的标准品。
  3. Zeba spin desalting columns micro(Pierce Antibodies,目录号:89877和89878)
  4. 甲醇(质量等级)

设备

  1. 微量离心机
  2. 定量LC-MS(例如HPLC偶联的三重四极杆)
  3. Eppendorf蛋白LoBind管(0.5ml和1.5ml)
  4. LCQuan软件(Thermo Fisher Scientific)

程序

  1. 在每个Zeba柱上加入200μlMS级水,并以1500×g旋转2分钟。 将柱子放在另一根干净的管子上。
  2. 混合10微升蛋白质和1微升连续稀释(通常至少10点,以涵盖1000倍范围)的小分子在管中。
  3. 移液器混合并室温孵育15分钟。
  4. 将每个管中的混合物转移至Zeba柱,放置1分钟。 然后下旋。
  5. 向每个管中加入40μlMS级甲醇,移液管混合物并在4℃以最大速度5分钟旋转。
  6. 将上清液转移到小瓶中的玻璃插入物中用于质谱分析。
  7. 每个样品将与连接混合物中使用的最终浓度的小分子的连续标准溶液一起加载3次。 在LCQuan软件或其他适当的软件中进行定量

参考文献

  1. Li,X.,Gianoulis,T.A.,Yip,K.Y.,Gerstein,M。和Snyder,M。(2010)。 体内广泛的代谢物 - 蛋白质相互作用通过大规模系统分析揭示 。 Cell 143(4):639-650。
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Copyright: © 2011 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Li, X. (2011). Protein-ligand Binding Assay by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Bio-protocol Bio101: e124. DOI: 10.21769/BioProtoc.124;
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