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[Bio101] Colony PCR Using Yeast Spheroplasted Cells
[Bio101] 酵母球状体细胞的菌落PCR   

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本文章节

Abstract

The first part of this protocol involves the removal of yeast cell walls using the Zymolase enzyme. The resulting spheroplast cells can then be used as template for PCR. This quick and easy to implement protocol describes how to prepare spheroplasted yeast cells for colony PCR.

Materials and Reagents

  1. Spheroplasted yeast cells
  2. Zymolase 20 T [AMS Biotechnology (Europe)]
  3. Sorbitol
  4. Sodium phosphate
  5. Zymolyase solution (see Recipes)

Equipment

  1. Sterile pipette tips
  2. Standard laboratory PCR machine
  3. Wooden toothpicks

Procedure

  1. Touch an average-size yeast colony (0.5-2 mm) or a cell pellet from a liquid culture with a sterile pipette tip.
    Note: Intact cells, a colony on a plate or liquid cultures which are stored at 4 °C for up to 3 months could still be used for this method. Wooden toothpicks should be avoided because they may interfere with either the release of DNA from yeast cells or the PCR reaction itself.
  2. Rinse the cells off the tip with 10 μl Zymolase solution by pipetting up and down, this spheroplasts them.
  3. Incubate for 10 min at 37 °C.
  4. Use 2 μl spheroplasted yeast cells for 50 μl PCR reaction.
    Note: Spheroplasted cells should be made fresh; if not, the PCR will not be as efficient.
  5. Zymolyase solution

Recipes

  1. Zymolyase solution
    2.5 mg/ml Zymolyase (20 T)
    1.2 M sorbitol
    0.1 M Na phosphate (pH 7.4)
    Aliquots of Zymolyase solution can be stored at -20 °C for at least 6 months.

Acknowledgments

This protocol has been modified and adapted in the Espenshade Lab, Johns Hopkins School of Medicine. Funding to support different projects that have used this protocol has come from NIH – National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Pancreatic Cancer Action Network, and the American Heart Association.

References

  1. Chen, H. R., Hsu, M. T. and Cheng, S. C. (1995). Spheroplast preparation facilitates PCR screening of yeast sequence. Biotechniques 19(5): 744-746, 748.
  2. Ling, M., Merante, F. and Robinson, B. H. (1995). A rapid and reliable DNA preparation method for screening a large number of yeast clones by polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res 23(23): 4924-4925.

简介

该方案的第一部分涉及使用酵母裂解酶去除酵母细胞壁。 然后可将所得的原生质球细胞用作PCR的模板。 这个快速和容易实施协议描述如何准备原生质球酵母细胞殖民地PCR。

材料和试剂

  1. 原生质球酵母细胞
  2. Zymolase 20 T [AMS Biotechnology(Europe)]
  3. 山梨醇
  4. 磷酸钠
  5. 酵素溶液(见配方)

设备

  1. 无菌移液器吸头
  2. 标准实验室PCR机
  3. 木牙签

程序

  1. 用无菌移液器吸头从平均体积的酵母菌落(0.5-2 mm)或液体培养基中取出细胞沉淀。
    注意:完整的细胞,在4℃下储存长达3个月的平板上的菌落或液体培养物仍然可以用于该方法。 应避免使用木制牙签,因为它们可能会干扰酵母细胞中的DNA释放或PCR反应本身。
  2. 用10μlZymolase溶液冲洗细胞顶端,通过上下吹吸,这种球状化他们。
  3. 在37℃孵育10分钟。
  4. 使用2μl原生质球酵母细胞进行50μlPCR反应 注意:球形细胞应该是新鲜的; 如果没有,PCR将不会有效。
  5. 酵素溶液

食谱

  1. 酵素溶液
    2.5mg/ml酵母聚糖酶(20T) 1.2M山梨醇 0.1M磷酸钠(pH7.4) 等分的溶液酶溶液可以在-20℃下保存至少6个月

致谢

该协议已经在约翰霍普金斯医学院的Espenshade实验室中修改和改编。 资助支持不同的项目,使用这个协议来自NIH - 国家心脏,肺和血液研究所,国家过敏和传染病研究所,胰腺癌行动网络和美国心脏协会。

参考文献

  1. Chen,H.R.,Hsu,M.T.and Cheng,S.C。(1995)。 原生质体制备便于酵母序列的PCR筛选。 Biotechniques 19(5):744-746,748。
  2. Ling,M.,Merante,F.和Robinson,B.H。 通过聚合酶链反应筛选大量酵母克隆的快速可靠的DNA制备方法。/a> Nucleic Acids Res 23(23):4924-4925
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引用:Tong, Z. (2011). Colony PCR Using Yeast Spheroplasted Cells. Bio-protocol Bio101: e10. DOI: 10.21769/BioProtoc.10;
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useful
11/19/2012 1:16:05 AM Reply